天麻素对次黄嘌呤诱导小鼠急性高尿酸血症的影响和机制研究

褚亚慧 孔维佳

中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所病毒室，北京 100050

天麻素（gastrodin，GAS）是中药天麻的主要有效成分之一，可由天麻的根茎中提取或化学合成获得。研究发现除了治疗神经系统疾病，GAS 还具有其他多种药理作用[1-4]。最近的研究发现，GAS 用于四氯化碳诱导的小鼠肾损害模型具有降尿酸（uric acid，UA）作用[5]，但其机制尚不明确。高尿酸血症（hyperuricemia，HUA）可导致痛风和肾功能损害，并与一些代谢性疾病和循环系统疾病的发生和发展密切相关[6-7]。本实验以次黄嘌呤诱导小鼠的急性HUA，并研究了GAS 的降UA 作用和可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药品和试剂

GAS 购自上海麦克林生化科技有限公司（批号：C10915097），别嘌呤醇（allopurinol，ALLO）、次黄嘌呤和羧甲基纤维素钠购自美国Sigma 公司，血清生化指标检测试剂盒购自北京中生北控生物科技有限公司。黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究有限公司。QIAsymphony RNA Kit 购自德国QIAGEN 公司，GoScriptTM反转录系统和GoTaq®qPCR Master Mix 试剂盒购自美国promega 公司。

1.1.2 实验动物

雄性昆明种小鼠50 只，体重18～20 g，购自北京康蓝生物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2019-0011。所有动物于SPF 级动物房适应性饲养一周后开始实验，自由饮水，投喂常规啮齿类颗粒饲料。

1.1.3 仪器

7100 型全自动生化分析仪购自QIAGEN 公司，NanoDrop 2000 型超微量分光光度计购自美国Thermo Fisher Scientific 公司，ABI 7500 Fast 实时荧光定量PCR 仪购自美国ABI 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物实验

实验方案由医药生物技术研究所伦理委员会审核通过，动物实验的操作和流程遵循中国实验动物学会《实验动物教学用动物使用指南》[8]。动物随机分为5 组，每组10 只，分别为正常组、模型组、GAS 200 mg/kg组、GAS 400 mg/kg 组和ALLO 10 mg/kg 组。正常组和模型组每日灌胃同等体积0.5%羧甲基纤维素钠，其余各组每日灌胃给药。药物于0.5%羧甲基纤维素钠溶液中溶解，灌胃体积为0.3 ml/只，持续14 d。

第13 天晚上8∶00 所有动物禁食，第二天上午8∶00 最后一次灌胃给药。给药1 h 后除正常组外其余各组动物腹腔（intraperitoneal，i.p.）注射次黄嘌呤1000 mg/kg[9]。次黄嘌呤溶解于0.5%羧甲基纤维素钠溶液中，注射体积为0.2 ml/只。注射45 min 后[9]所有动物眼眶取血置于离心管中，二氧化碳麻醉处死后取肝脏和肾脏置液氮中快速冷冻，然后于-80℃冰箱中冻存。

血标本于室温静置2 h 后以3000 rpm（r=7 cm）离心10 min 分离血清。每个血清标本取0.2 ml，分别用相应试剂盒并参考说明书在全自动生化分析仪上测定UA、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血清肌酐（serum creatinine，SCr）、丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和天门冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）等生化指标。

1.2.2 肝脏XOD 活力测定

每只小鼠称取约0.2 g 肝组织，以0.9%生理盐水按重量体积比1∶9 制成10%匀浆液。于3000 r/min，半径7 cm 离心10 min，然后取上清按照试剂盒说明书进行测定。反应结束后以分光光度计测量530 nm 的吸光度，结果以U/g 肝组织表示。

1.2.3 组织RNA 提取、反转录和实时荧光定量PCR

以试剂盒提取肾组织总RNA 并进行反转录。反转录的反应体系、温度和时间等条件参考文献报道[10]，反应结束后样品置-20℃冻存。定量PCR 的基因特异性引物见表1，PCR 反应体系、条件和循环数参考文献报道[10]。反应结束后以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参对目的基因包括尿酸盐转运蛋白1（urate transporter 1，URAT1） 和有机阴离子转运蛋白1（organic anion transporter 1，OAT1）（表1）进行校正，并以文献报道[10]的方法计算目的基因的相对表达水平，结果以正常组的倍数表示。

表1 实时荧光定量PCR 小鼠引物（5′-3′）

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用Newman-Keuls检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GAS 减轻次黄嘌呤诱导的小鼠急性HUA

模型组小鼠血清UA 水平高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.001）。剂量为200 mg/kg 和400 mg/kg 的GAS 灌胃给药14 d 使小鼠血清UA 水平下降（与模型组比较，P＜0.05 或P＜0.01）。作为阳性对照药，剂量为10 mg/kg 的ALLO 灌胃给药14 d 使小鼠血清UA 水平下降（与模型组比较，P＜0.001），与正常组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。各组的BUN、Scr、ALT 和AST 比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

表2 GAS 和ALLO 对急性HUA 小鼠血清UA、肾功能和肝功能指标的影响（±s）

表2 GAS 和ALLO 对急性HUA 小鼠血清UA、肾功能和肝功能指标的影响（±s）

与正常组比较，aaaP＜0.001，与模型组比较，bP＜0.05、bbP＜0.01、bbbP＜0.001

组别UA（μmol/L）BUN（mmol/L）SCr（μmol/L）ALT（U/L）AST（U/L）正常组（n=10）模型组（n=10）GAS 200 mg/kg 组（n=10）GAS 400 mg/kg 组（n=10）ALLO 10 mg/kg 组（n=10）163.5±21.1 620.8±124.4aaa 504.4±47.6b 373.8±43.1bb 140.5±28.1bbb 6.77±0.72 6.99±0.74 6.43±0.58 6.91±0.70 6.76±0.33 52.20±4.83 56.83±6.93 54.05±4.87 54.81±5.19 56.80±8.46 34.82±4.93 33.09±5.20 32.50±5.39 33.57±4.17 35.33±3.80 131.7±15.9 136.2±16.9 128.3±13.2 133.0±14.1 138.4±19.9

2.2 GAS 抑制小鼠肝脏XOD 活力

模型组小鼠肝脏XOD 活力高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.01）。200 mg/kg 和400 mg/kg 的GAS使小鼠肝脏XOD 活力下降（与模型组比较，P＜0.05 或P＜0.01）。ALLO 使小鼠肝脏XOD 活力下降（与模型组比较，P＜0.01），与正常组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（图1）。

与正常组比较，aaP＜0.01；与模型组比较较，bP＜0.05、bbP＜0.01

2.3 GAS 下调小鼠肾脏URAT1 而上调OAT1 的mRNA 表达

模型组小鼠肾脏URAT1 的mRNA 表达水平高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.01）（图2A），而OAT1的mRNA 表达水平低于正常组，差异有统计学意义（P＜0.01）（图2B）。200 mg/kg 和400 mg/kg 的GAS 使小鼠肾脏URAT1 的mRNA 水平减少（与模型组比较，P＜0.05 或P＜0.01）（图2A），同时使OAT1 的mRNA水平增加（与模型组比较，P＜0.05 或P＜0.01）（图2B）。ALLO 使小鼠肾脏URAT1 和OAT1 的mRNA 表达水平恢复（与模型组比较，P＜0.01），与正常组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2 GAS 和ALLO 对急性HUA 小鼠肾脏URAT1（A）和OAT1（B）mRNA 表达水平的影响（n=10，±s）

3 讨论

本研究探讨了GAS 对小鼠急性HUA 的作用，并报道了GAS 降UA 的可能机制。次黄嘌呤是UA 生物合成的前体物质之一[11]，本实验通过i.p.注射次黄嘌呤成功复制了小鼠急性HUA 模型，并发现剂量为200 mg/kg 和400 mg/kg 的GAS 灌胃给药具有明显的降UA 作用，能有效减轻小鼠HUA。该结果与近期Ma等[5]的研究结果相一致，提示GAS 对不同因素诱导的小鼠血清UA 升高均具有抑制作用。

XOD 主要分布于肝脏和肠道等组织，是UA 合成的关键酶，也是ALLO 等降UA 药物的主要作用靶点之一[11]。本研究结果显示，GAS 使小鼠肝脏XOD的活力下降，提示GAS 能抑制肝脏中UA 的合成。另有研究发现，在体外无细胞的反应体系中，浓度低至0.1 μmol/L 的GAS 即能有效抑制XOD 的催化活性，使UA 的产生量明显减少[12]。本文的结果与之符合，并进一步证明了GAS 在体内对XOD 活力的抑制作用。

URAT1 和OAT1 分别参与肾小管对UA 的重吸收和分泌，在维持体内尿酸代谢平衡方面发挥重要作用[13-14]。目前，URAT1 抑制剂是降尿酸和抗痛风药物的研发热点，并且已有多个候选药物进入临床试验阶段[15-16]。本研究结果显示，小鼠i.p.注射次黄嘌呤后肾组织URAT1 的mRNA 表达升高而OAT1 的mRNA表达下降，提示肾脏对UA 的重吸收增加而分泌减少。GAS 灌胃给药后明显下调URAT1 的mRNA 表达同时上调OAT1 的mRNA 表达，说明GAS 能抑制肾脏对UA 的重吸收并增加其分泌，从而促进UA 从体内排泄。

目前临床常用的降尿酸药物有ALLO、非布司他、苯溴马隆、丙磺舒等。这些药物通常有较多不良反应，如过敏反应、药物性肝炎、消化道反应、血象异常等，并不适合长期应用[17-19]。临床上口服GAS 不良反应轻微且多呈一过性，大多无需停药或特殊处理，且未见报道有肝肾功能损害等严重不良反应[20-21]。GAS的良好安全性为其进一步研发用于新的临床适应证奠定了基础。

综上所述，GAS 灌胃用于次黄嘌呤诱导的小鼠急性HUA 能有效降低血清UA 浓度，其机制可能与抑制肝脏XOD 活力以及调控肾脏URAT1 和OAT1 的mRNA 表达有关，具有一定的开发和应用前景。