陇南野生中华猕猴桃组培快繁体系的建立

陈强 田凤鸣 何九军 王永斌 刘琼

摘要：以陇南野生中华猕猴桃种子为材料，在无菌条件下培养萌发产生实生苗，将无菌实生苗地上部分转接到培养基上建立的初代培养体系为基础，发现继代增殖最适培养条件为：MS+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.4 mg/L+GA3 0.2 mg/L，生根培养最适条件为1/2 MS+IBA 0.6 mg/L;用商品基质在温室移栽组培苗，成活率可达87.5%。

关键词：野生中华猕猴桃;无菌实生苗;组织培养;快繁体系

中图分类号：S663.4;Q943.1   文献标志码：A   文章编号：1001-1463（2021）10-0035-04

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2021.10.009

Establishment of Tissue Culture and Rapid Propagation System of Wild Kiwifruit in Southern Gansu Province

CHEN Qiang 1， 2， TIAN Fengming 1， 2， HE Jiujun 1， 2， WANG Yongbin 1， 2， LIU Qiong 1

（1. College of Life Science，Longnan Teacher College， Longnan Gansu 742500， China; 2. Center for Research and Development of Longnan Characteristic Agro-Bioresource， Longnan Gansu 742500， China）

Abstract：The seeds of Actinidia chinensis var. Longnan were used as explants to produce seedlings under aseptic conditions. Based on the primary culture system established by transferring the above ground part of aseptic seedlings to the medium， it was found that the optimum conditions for subculture and multiplication were MS+6-BA 2.5 mg/L + NAA 0.4 mg/L+GA3 0.2 mg/L， and the optimum conditions for rooting culture were 1/2 MS+IBA 0.6 mg/L， The survival rate of tissue culture seedlings can reach 87.5% by transplanting in greenhouse with commercial substrate.

Key words：Wild kiwifruit; Aseptic seedling; Rapid propagation system

獼猴桃俗称阳桃、山洋桃、毛桃等，属猕猴桃科猕猴桃属多年生藤本植物。猕猴桃果实质地柔软、风味独特，味道鲜美， 是一种营养丰富的保健型水果[1 - 2 ]，富含维生素C、膳食纤维和多种矿物质元素[3 - 5 ]。猕猴桃原产于我国，陇南所产为中华猕猴桃，康县，文县、武都区、成县等地均有分布[6 ]。

野生中华猕猴桃的生存状况堪忧，这对其资源的保存和快繁提出了更高的要求。目前最常用的繁殖方式中，嫁接繁殖由于砧木质量不一，增大了猕猴桃溃疡病的感染率。猕猴桃溃疡病由细菌引起，病因多种，难以控制[7 - 8 ];而扦插繁殖生根较难，成活率低，中华猕猴桃生根率仅为28.3% [9 - 10 ];植物组织培养具有周期短、繁殖系数高、苗木一致性高等优点[11 ]，且可克服有性繁殖造成的品种退化等问题，已成为植物大量快繁和保存的首选方法[12 ]。在外植体选择上，不同的研究者提出了可行的材料，猕猴桃种子体积小，数量多，以种子为外植体在无菌条件下操作方便，不受季节限制[13 ]，易于观察植株生长发育状态，短期内可快速获得大量无菌苗[14 ]，有利于猕猴桃实生再生体系建立和种质快繁[15 ]。尤其在砧木的选育中，选择种子作为外植体，能够从丰富的变异中筛选较为优秀、脱毒效果较好且质量均一的砧木苗。我们以陇南野生中华猕猴桃种子为材料，在无菌条件下培养实生苗，将无菌实生苗地上部分转接进行继代增殖培养和生根培养，然后用商品基质在温室移栽组培苗，建成了适合陇南地区的野生中华猕猴桃的组织培养快繁体系，现报道如下。

1   材料与方法

1.1   外植体的建立

供试外植体材料为野生中华猕猴桃 （Actinidia lindl. sp.）种子，来源于甘肃省陇南市文县。采集完全成熟的猕猴桃果实，取出种子用自来水冲洗干净，置培养皿中自然阴干。将经过无菌处理后的种子接入培养皿的双层滤纸上，用封口膜包好，放入培养室（温度25 ℃±2 ℃，相对湿度50%）在暗光无菌条件下进行初代培养[16 ]。选择生长良好、无杂菌感染初代培养幼苗茎尖和或腋芽，作为继代增殖培养的材料备用[16 ]。

1.2   试验方法

1.2.1   继代增殖培养   参考赵许朋等[12 ]的方法，略作修改。增殖培养基共设7个植物生长调节剂组合处理，分别为S1（CK）、S2、S3、S4、S5、S6、S7（表1），选取长度为0.8 cm左右的再生芽，转移至芽增殖培养基，30 d后统计增殖芽数并计算增殖倍数。

1.2.2   生根培养   参考赵许朋等[12 ]的方法，略作修改。共设6个4 -吲哚- 3 -基丁酸（IBA）浓度处理，分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L（表2），其中对照为加入等量无菌蒸馏水。选取长2～3 cm的不定芽，接种至含有不同浓度IBA的1/2MS （大量元素减半）固体培养基中，35 d后统计生根率和平均生根数（根总数/接种芽数）。

1.2.3   培养条件   继代增殖培养和生根培养均在无菌条件下进行，基本培养基为MS（由杭州木木生物科技有限公司提供），生根培养为1/2MS（含琼脂8 g/L、蔗糖30 g/L，pH 5.85），温度（25±2） ℃，光照4 500 mol/（m·s），光周期设定光照14 h，黑暗10 h。培养基的植物调节剂均为国产分析纯。

1.2.4   炼苗移栽   在室温20 ℃下控制空气湿度在80%以上，将培养瓶瓶盖拧松或棉塞拔开放置2 d，直接敞口1/3放置2 d，直接敞口1/2放置2 d，完全敞口放置1 d。将组培苗取出，清洗培养基，使用商品基质移栽，适量浇水，在温室条件下培养进行生长观察20 d后统计成活率。

2   结果与分析

2.1   不同植物生长调节剂组合处理对猕猴桃不定芽的增殖的影响

在接种24 d后，S5 培养基上猕猴桃不定芽的增殖效果显著地高于其他处理。NAA浓度为0.2、0.4 mg/L时，增殖倍数总体较对照有所增加，除S3处理与对照增加不显著外，其余处理均较对照显著增加。不同6-BA浓度处理的增殖倍数除S3处理与对照增加不显著外，其余处理均较对照增加显著。可见，在7个组合处理中，添加6-BA的浓度较大时，不定芽的增殖倍数有不同程度的减少，而过高的NAA浓度却不会出现类似情况（表1）。

2.2   植物生长调节剂IBA对猕猴桃生根的影响

4-吲哚-3-基丁酸（IBA）可由茎、叶吸收，移动性很小，但生物活性较为持久，其作用类似内源生长素，诱发产生不定根[17 ]。从表2可以看出，中华野生猕猴桃不定芽的生根率及平均生根数，并没有随着IBA浓度的升高而呈现出一直升高的趋势，而是呈现先增后减趋势。在过高IBA浓度（1.0 mg/L）下的生根表现仅优于G1处理（CK）和G2处理，且差异不显著。G3、G4、G5处理均较G1处理（CK）和G2处理差异显著，其中以G4处理（IBA浓度0.6 mg/L）生根情况最优，生根率最高，为90%;平均生根数最多，为4.82条/芽，与其余处理均差异显著。因此，生根培养时，应当选择IBA的最佳浓度为0.6 mg/L。从表2还可以看出，没有加入IBA的G1处理（CK）生根时间均较其余处理有所延长。

2.3    移栽成活率

野生中华猕猴桃组培苗完成炼苗并洗干净根部的培养基残留，使用商品基质将组培苗移栽到种植盆中，并浇透水，置于智能温室中培育。移栽2 d后，浇少量的MS营养液（去除蔗糖和琼脂），20 d后统计成活率时发现，移栽的24株野生中华猕猴桃组培苗植株中，成活21株，死亡3株，成活率达87.5%，效果较好。

3   结论与讨论

试验结果表明，以陇南野生中华猕猴桃种子为材料，在无菌条件下培养萌发产生实生苗，将无菌实生苗地上部分转接到培养基上发现继代增殖最适培养条件为：MS+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.4 mg/L+GA3 0.2 mg/L，最适生根培养条件为1/2 MS+IBA 0.6 mg/L，用商品基质在温室移栽野生中华猕猴桃组培苗，成活率可達87.5%。

从野生资源的获取来说，野生中华猕猴桃比较易于收集的就是种子，而且不是破坏性取样，这是选择种子作为外植体来源的原因之一。另外，猕猴桃茎、叶片均被有绒毛，在外植体的消毒中很难到达良好的效果，因此从种子开始培养获得外植体，建立初代培养体系是比较好的选择。

研究显示，培养基中植物生长调节剂种类及浓度配比是猕猴桃组织培养成功的关键因子之一[18 ]。王林青[19 ]以3个品种的猕猴桃顶芽、带芽茎段为外植体研究时发现，在NAA为0.1 mg/L 时萌芽率最高;6-BA浓度过低会抑制芽的生长，过高则愈伤组织增多，出苗率不高。薛莲等[18 ]的研究发现，添加1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA时增殖系数较高，植株生长健壮;若6-BA浓度过高，植株基部愈伤组织膨大，并伴有褐变及玻璃化现象。本研究显示，6-BA的浓度不宜过高，在NAA浓度0.4 mg/L（较高水平）、6-BA浓度2.5 mg/L、GA3浓度0.2 mg/L的条件下，野生中华猕猴桃继代增殖效果比较明显，与其余组合处理之间差异显著，且猕猴桃试管苗也生长良好，叶片正常。

在野生猕猴桃的生根培养中，于非[20 ]研究发现，野生软枣猕猴桃组培苗生根培养基的IBA浓度在0.2～0.5 mg/L时生根效果最好，IBA浓度为1.0 mg/L生根率下降到50%。本研究发现，当IBA浓度为0.6 mg/L时，陇南野生中华猕猴桃有最高的生根率，为90%，且平均生根数也最多，达到了4.82条，这基本和于非[20 ]的结论相符，而且不同IBA浓度设定更加能发映出IBA浓度对生根效果的影响。

研究中我们还发现，野生中华猕猴桃种子量过多时发芽率较低，这可能与封口后影响了种子的呼吸作用有关[14 ]，需要进一步研究。

参考文献：

[1] 刘   丹，李然红，陈   鑫.  锌胁迫对狗枣猕猴桃幼苗生长发育的影响[J].  甘肃农业科技，2018（4）：29-31.

[2] 刘   丹，杜泽宇，陈   鑫，等.  NaCl和NaHCO3混合盐对狗枣猕猴桃幼苗生长发育的影响[J].  甘肃农业科技，2018（5）：3-6.

[3] 高敏霞，冯   新，赖瑞联，等.  猕猴桃组织培养研究进展[J].  东南园艺，2017，5（3）：50-56.

[4] 黄宏文.  猕猴桃研究进展[M].  北京：科学出版社，2014.

[5] BOEING H，BECHTHOLD A，BUB A，et al. Critical review：vegetables and fruit in the prevention of chronic diseases[J].  Eur. J. Nutr.，2012，51：637-663.

[6] 省农科院经作所，武都地区农业局，康县农业局.  陇南中华猕猴桃分布调查[J].  甘肃农业科技，1981（4）：34-35.

[7] 高小宁，赵志博，黄其玲，等.  猕猴桃细菌性溃疡病研究进展[J].  果树学报，2012，29（2）：262-268.

[8] 王   月，董   俊，吴   群，等.  猕猴桃溃疡病菌质粒的分离与功能分析[J].  华中农业大学学报， 2018，37（3）：39-45.

[9] ERTURK，YASAR，ERCISLI，et al. Effects of plant growth promoting rhizobacteria（PGPR）on rooting and root growth of kiwifruit （Actinidia deliciosa）stem cuttings[J].  Biological Research，2010，43（1）：91-98.

[10] 钟彩虹，刘小莉，李大卫，等.  不同猕猴桃种硬枝扦插快繁研究[J].  中国果树，2014（4）：23-26;86.

[11] 黄东梅，吴   斌，马伏宁，等.  不同消毒剂及激素对黄果西番莲茎段组织培养的影响[J].  热带农业科学，2019，39（12）：16-20.

[12] 赵许朋，赵晓朋，施   豪，等.  ‘贵长猕猴桃叶片高效直接再生体系的建立[J].  中国生物工程杂志，2018，38（10）：48-54.

[13] 江   涛，李晨曦，陈   磊，等.  毛竹组织培养中成熟种子消毒方法[J].  江苏农业科学，2017，45（4）：103-106.

[14] 涂俊凡，秦仲麒，李先明，等.  沙梨种子组织培养技术研究[J].  中国南方果树，2016，

45（5）：121-123.

[15] 袁   芳，李   晶，任海平，等.  藏藥匙叶翼首草高频组织培养再生体系优化研究[J].  西北植物学报，2017，37（2）：379-386.

[16] 陈   强，田凤鸣，王永斌，等.  陇南野生中华猕猴桃实生苗初代培养体系的建立[J].  现代农村科技，2021（7）：63-64.

[17] 张宗检.  植物生长调剂科学使用指南[M].  北京：化学工业出版社，2016.

[18] 薛   莲，古咸彬，王国军，等.  猕猴桃实生组培快繁体系的建立[J].  中国南方果树，2020，49（1）：126-129.

[19] 王林青.  猕猴桃组织培养快繁技术研究[D].  杨凌：西北农林科技大学，2017.

[20] 于   非.  野生软枣猕猴桃组织培养快繁体系的建立[J].   中国园艺文摘，2017，33（6）：17-18;30.

（本文责编：郑立龙）

收稿日期：2021 - 07 - 19;修订日期：2021 - 08 - 15

基金项目：陇南市科技指导性计划项目“陇南野生猕猴桃组培快繁体系的建立”（2019-ZD-17）。

作者简介：陈   强（1986 — ），男，甘肃陇西人，讲师，研究方向为植物快繁体系。联系电话：（0）18219892104。