蚕卵自动计数方法的应用及计数效果分析

李枫烨，吴静颜，兰艳妮，黄扬玉，谭福洋，梁光健，浦月霞*

（1.广西壮族自治区蚕业技术推广站，南宁市530007；2.广西壮族自治区蚕业科学研究院，南宁市530007）

家蚕良种繁育制度采用三级繁育四级制种的形式，原原母种是良种繁育的最高种级。为了保持品种的优良性状、延长品种使用年限，原原母种的择优选留尤为关键。母种单蛾的产卵量和不良卵数是评判母蛾产卵质量的重要指标，也是催青期间进行卵期选择的重要参考。本研究在母种收蚁孵化后，对收蚁卵圈的孵化卵数、未孵化卵数、死卵数和不受精卵数进行调查计数，可计算出孵化率、不良卵率等调查数据，为母种进行优选留种提供数据支撑。

广西壮族自治区蚕业技术推广站（以下简称广西蚕业站）是广西唯一的原原母种繁育单位，承担全区主推品种的母种繁育任务，母种繁育品种多、数量多、责任大，因此调查蚕种孵化率、不良卵率的任务也十分艰巨，需要在短时间内调查所饲育的全部蚕种蛾圈。传统的蚕卵计数方法是用彩色笔手动打点，耗时长、效率低、强度大、操作人员易疲劳，如若期间受到干扰或打断时，常面临返工风险，随着操作人员疲劳感加重，计数结果的误差率也会增大。

经查阅相关资料得知，通过基于机器视觉的图像分析技术来实现自动计数的计数方式已经大量应用到了生物学科的研究上。如马健锦［1］设计的菌落自动计数软件，是通过利用Open CV 库函数对培养皿图像进行滤波、灰度化、二值化、查找轮廓、色差比对、形态学比对等一系列操作，找出识别、分割、统计出图片中菌落数量的准确方法。苏凌霄［2］以马铃薯晚疫病为研究对象，应用图像处理的方法对孢子图像开展计数研究，完成了基于图像处理的细胞计数系统软件的设计，该系统软件能够实现孢子图像的在线和离线获取，也能通过点击按钮完成孢子图像的各处理流程的结果预览和自动计数。万路瑶［3］以大豆（黄豆）为试验对象，分析了现有的两种黏连种子图像的分割计数方法，针对黏连种子区域分割效果不佳的问题，采用基于图像识别的方法先识别种子黏连类型后精准分割，实现了准确的种子计数。不同领域的研发人员会根据样品的实际图像效果采用不同的算法设计，以实现快速、准确的自动计数［4-7］。

图形识别计数软件应用范围广泛，但在纸面蚕卵识别上的应用还未见报道，而蚕卵作为相似的规则颗粒状样品，是可以很好地应用图像识别技术实现自动计数的。为了准确、快速地对母种收蚁卵圈的孵化卵数、未孵化卵数、死卵数和不受精卵数进行统计分析，广西蚕业站联合软件设计人员研发了纸面蚕卵计数系统（以下简称计数系统），形成一套纸面蚕卵自动计数方法，并将其与人工计数的工效进行对比分析，以期更好地提高该方法的科学性、实用性。

1 蚕卵自动计数方法

1.1 蚕卵自动计数的应用场景

蚕卵自动计数方法通常应用于收蚁后卵圈的卵粒计数。原原母种的繁育采用单蛾区饲育，催青期选择发育良好的卵圈包种收蚁，收蚁后的卵圈经过扫描仪形成图像导入计算机程序，通过色块识别、分割等图像分析技术标记卵粒并进行计数。该方法也可用于收蚁前的卵圈卵粒计数，但存在影响孵化的情况，一是卵圈暴露在光照环境下影响蚕卵发育，二是用扫描仪取像时易压坏蚕卵。

1.2 仪器设备和材料

1.2.1 仪器设备 EPSON DS1610 平板式扫描仪，由精工爱普生株式会社生产。联想510S 台式电脑，由联想LENOVO生产。

1.2.2 材料 桂蚕8号的4个母种锦（9MN）、绣（芙H）、壮（7MH）、丽（87H）的蚕卵由广西蚕业技术推广站家蚕遗传育种研究室提供。

1.3 蚕卵自动计数操作流程

蚕卵自动计数的操作流程见图1。

图1 蚕卵自动计数的操作流程

1.4 蚕卵自动计数方法步骤

1.4.1 扫描仪取像 将卵壳圈整齐排列，置于平板式扫描仪的扫描区域后，合上盖子，按下扫描键一步完成扫描和存储。所使用扫描仪1 次最多可同时取像24 个卵圈。为了演示清楚，下面图示将使用2 个卵圈的计数过程作描述（图2）。

1.4.2 导入图片到计数软件 打开计数软件，点击“打开图片”按钮，选择需要处理的图片，点击确定，把待计数的卵圈图片导入程序的主界面。

1.4.3 检测目标区 图片导入后，点击“检测目标区”按钮，对卵圈进行计数区域的框选。此步骤可以手动校正框选区域，以免出现框选卵圈不完整的情况。

1.4.4 自动计数 点击“蚕种计数”按钮，程序即对图片上的所有卵圈按设定的排列规则进行逐一编号，然后开始标记计数，并在界面右边数据区域显示出蚕卵初步计数结果（图2）。

图2 蚕卵计数

1.4.5 手动编辑校正 操作人员逐一检查每个卵圈初步计数的标记准确度，对少量错标、多标的蚕卵进行取消标记修正，对漏标的情况用不同颜色增加标记修正（图3）。手动编辑的数量也会相应列示在界面右边的表格里，此时的计数结果随着手动编辑数校正而修正。

图3 手动编辑校正

1.4.6 导出Excel 文件及计数图 计数完成后，点击“导出计数结果为Excel文件”按钮，可把计数结果以Excel 文件导出保存，点击“保存计数图”按钮，可以保存计数图片。

1.5 选取家蚕品种和计数设置

选取桂蚕8 号的4 个母种锦（9MN）、绣（芙H）、壮（7MH）、丽（87H）的母种卵圈进行自动计数和人工计数比较。收蚁后对以上4 个品种分别随机抽取10个卵圈，共40 个卵圈，先用电脑自动计数方法计数，后用人工点数方法进行计数，对比计数结果及所需时长，分析计数效果。

2 计数效果分析

2.1 计数准确率分析

以人工计数为对照，人工计数与自动计数对比分析见表1。从表1可以看出，品种锦、壮的自动计数结果小于人工计数结果的情况较绣、丽多，即漏标卵粒更多，估计是由于锦、壮卵壳颜色较接近蚕种纸的颜色导致。品种绣、丽的初步偏差值多为正数，平均值分别为27 粒和28 粒。估计与绣、丽的卵粒数较多、排列更紧密，图像识别难度加大有关，更容易发生错标、多标。初步计数的结果显示，锦、绣、壮、丽4个品种的平均偏差比例分别为3.63%、4.97%、3.55%、4.54%，偏差比例均在5%之内，属可接受范围，已基本满足实用化的需求。经编辑校正后，锦、绣、壮、丽4 个品种的平均偏差比例分别为0.63%、0.66%、0.84%、1.44%，除品种丽外，其余3 个品种的平均偏差比例均小于1%，相比自动直接计数有了大幅度降低，误差可忽略不计。值得一提的是，手动校正的准确度与时长成正比，但为了兼顾效率与准确度，试验认为目前手动校正所用时长及修正程度是较为合理的。

表1 40个卵圈的人工计数与电脑计数数据对比

续表1

2.2 计数工效分析

设定每次扫描识别20 个卵圈，从开始计数到生成Excel文件为标准流程，对比分析人工计数与自动计数2 种方法的工效。人工计数的时长是在保证计数人的操作准确、速度快且身体不疲劳的前提下进行统计，共记录了4位技术人员所用时长（表2）。自动计数在操作过程中，时间主要消耗在手动编辑校正的环节，如前文所述，目前手动校正所用时长及修正程度是兼顾了效率与准确度，因此是较为合理的。经计算得出，不经过手动编辑校正的自动计数，工效比人工计数提高42～48 倍，加上手动编辑校正的时长后，工效比人工计数亦提高7～8倍。实际上，扫描仪每次最多可取像24 个卵圈，而工人的精力有限，就母种繁育中蚕种计数的实际工作量而言，在手动编辑校正过后，自动计数方法的工效会比人工计数提高7～8倍。

表2 40个卵圈的自动计数与人工计数时长对比

3 小结与讨论

3.1 小结

通过对蚕卵人工计数与自动计数效果进行对比分析，显示自动计数方法操作简便、省时高效，自动计数与人工计数的4 个品种的平均偏差比例分别为3.63%、4.97%、3.55%、4.54%，偏差率均小于5%，已基本满足实用化的需求。蚕卵自动计数的工效比人工计数的工效提高42～48倍。经手动编辑校正，4个品种的平均偏差率分别为0.63%、0.66%、0.84%、1.44%，蚕卵自动计数的工效比人工计数的工效提高7～8 倍，蚕卵自动计数法省力高效，误差小，解决了以往人工计数耗时长、效率低、用眼强度大、易疲劳且不能长时间连续工作的问题。

本套蚕卵自动计数方法是通过平板式扫描仪获得图像，与通过数码相机、智能手机等拍照获得图像的方式相比，具有扫描成像不受环境光源的影响，大大减少了图像的灰度差异的优点，为计数软件处理图像提高准确度和效率提供了良好的条件；与通过高清摄像头将样品置于封闭空间内取像相比，该方式只需要基本的办公设备就可操作，具有操作简单、使用方便、价格低廉和容易普及等优势。并且计数软件可将计数结果直接形成Excel文件并导出，为技术人员节省了整理数据的时间。

3.2 讨论

蚕卵自动计数方法在实际操作时，程序自动计数存在一定的误差，并存在影响计数准确率的可能因素：一是不同品种的卵圈形状、产附排列影响准确性；二是单圈卵粒数越多，卵粒排列越紧密，容易发生漏标和错标；三是不同品种的卵壳颜色与蚕种纸底色相似时，容易发生错标；四是不受精卵、死卵等不良卵颜色与孵化卵卵壳色不同，会发生漏标。

针对以上的问题，应继续对计数软件进行技术上的升级，并进一步完善自动计数方法的整套流程。首先是通过软件输入大量的数据入库，提高软件识别图像的处理能力，精准抓取每一粒蚕卵，减少因不同品种、不同产附密度对准确度的影响；定制应用于自动计数方法的母种专用蚕种纸，使得卵壳颜色与蚕种纸底色对比更明显，能显著提高软件处理图像的准确度。通过软件升级和配套使用专用蚕种纸，可提高直接计数的准确率，减少手动编辑校正的操作，大幅度提高蚕卵计数的工效。

目前的计数方法只能实现统计总卵粒数，在处理图像时不能区分已孵化卵、未孵化卵、不受精卵、死卵，不良卵的情况仍然依靠人工肉眼来辨别统计，这也是一项较耗时、易疲劳的工作。今后的研究方向便是开发计数软件的识别与统计未孵化卵、不受精卵、死卵等不良卵数据的功能，可直接计算出孵化率、不受精率、死卵率等数据并形成Excel文件，彻底解决蚕卵计数的工作难题，实现蚕种筛选的一步到位。