王翠翠, 陈安琪, 董文阳, 杨恒力, 王文卓, 朱 斌,史雪岩*,, 梁 沛, 刘丰茂, 束长龙, 张 杰
(1. 中国农业大学 植物保护学院,北京 100193;2. 中国农业大学 理学院 应用化学系农药创新中心,北京 100193;3. 中国农业科学院 植物保护研究所,植物病虫害生物学国家重点实验室,北京 100193)
西兰花Brassica oleraceavar.italica(broccoli)属于十字花科头状花序芸薹属甘蓝种中的一个变种,含有丰富的碳水化合物、蛋白质、维生素及矿物质[1]。小菜蛾Plutella xylostella(L.),属鳞翅目菜蛾科,以幼虫为害白菜、萝卜、甘蓝、油菜等十字花科蔬菜[2]。在西兰花生产中,小菜蛾、菜青虫等鳞翅目害虫的危害严重,目前主要以化学杀虫剂防治为主,但化学杀虫剂的广泛应用,导致害虫产生抗药性和农产品出现农药残留等问题。近年来,许多中国的蔬菜产品由于农药残留超标而被限制出口至荷兰、波兰、英国、意大利和西班牙等欧盟国家。其中,西兰花在受到出口制约的蔬菜产品中占比最大[3],并且虫螨腈残留超标是导致西兰花产品出口受阻的原因之一[4]。因此,虫螨腈的残留问题引发了关注。
虫螨腈 (chlorfenapyr,图式 1) 属新型吡咯类化合物[5],是一种杀虫剂前体,在昆虫体内可经过多功能氧化酶转变为具有杀虫活性的化合物,通过抑制二磷酸腺苷 (ADP) 向三磷酸腺苷 (ATP) 转化而发挥杀虫作用[6]。虫螨腈对多种害虫具有胃毒和触杀作用,被广泛用于蔬菜害虫的防治。有研究表明,使用虫螨腈防治十字花科蔬菜甘蓝、花椰菜等作物上的甜菜夜蛾、小菜蛾等害虫效果显著[7-8]。但因虫螨腈是非极性化合物,具有水溶性差、在土壤中难降解及不易挥发等缺点,导致其在环境及农产品中的残留问题较为突出,制约了西兰花等蔬菜的出口[4,9]。
使用具有减量及增效作用的农药混配药剂进行害虫防治,对于减少农药污染,保障农产品安全,提高经济、环境、生态效益,均十分有利[10]。苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)是迄今研究最多、使用量最大的微生物农药[11],对鳞翅目、鞘翅目、双翅目等农林害虫均有较强的毒杀作用。但Bt 制剂在实际应用中具有杀虫速度相对较慢,生物活性易受外界环境 (温度、光照等) 影响而导致持效期较短等缺点[12-13]。将化学农药与Bt 合理混配,对于克服化学农药和Bt 的缺点,实现减药增效防治害虫、降低农残的目的均十分有利。目前已有研究报道了Bt 与有机磷类、拟除虫菊酯类、氨基甲酸酯类等杀虫剂混配后的增效作用,例如:李国清等[14]研究表明,Bt 与敌百虫以不同比例混配后,对棉铃虫防治具有显著增效作用,而不同比例的Bt 与氰戊菊酯混剂对棉铃虫防治的增效作用有所不同,有些混配剂显示了增效作用,有些却显示了拮抗作用;王武刚[15]研究表明,在田间用Bt 预处理棉铃虫卵,可以使氰戊菊酯对棉铃虫幼虫的田间防治效果提高60%~70%;张慧慧等[16]研究表明,Bt 和溴氰虫酰胺分别以50%的推荐剂量按1 : 1 的质量比混配,在药后3 和7 d对小菜蛾的防效分别达90.70%和82.82%。目前,已有多种Bt 与化学杀虫剂的复配制剂在中国登记使用。如Bt 与毒死蜱混配组成的可湿性粉剂被登记用于防治斜纹夜蛾Spodoptera litura(Fabricius),Bt 与高效氯氰菊酯组成的可湿性粉剂登记对象为十字花科蔬菜小菜蛾,Bt 与吡虫啉组成的可湿性粉剂可兼治烟青虫Helicoverpa assulta(Guenée) 和烟蚜Myzus persicae(Sulzer),Bt 与氟铃脲组成的可湿性粉剂登记对象为甘蓝甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hubner) 等[17]。
目前,Bt 与虫螨腈混配对小菜蛾的田间防效,以及西兰花上虫螨腈的残留消解动态,尚未见研究报道。因此本研究以小菜蛾为研究对象,比较了虫螨腈单剂、Bt 单剂、50%推荐剂量的虫螨腈单剂、50%推荐剂量的Bt 单剂、50%推荐剂量的虫螨腈与50%推荐剂量的Bt 混配使用对小菜蛾的田间防治效果,并研究了西兰花上虫螨腈的残留消解动态,以期为Bt 与虫螨腈混配进行小菜蛾等鳞翅目害虫的防治,减少西兰花上的虫螨腈残留提供依据。
供试药剂:虫螨腈 (chlorfenapyr) 标准品(98.1%,上海市农药研究所有限公司);10%虫螨腈悬浮剂 (chlorfenapyr 10% SC),法国巴斯夫欧洲公司;32 000 IU/mg 苏云金芽孢杆菌可湿性粉剂(Bacillus thuringiensis32 000 IU/mg WP),武汉科诺生物科技股份有限公司。
供试作物:西兰花Brassica oleraceavar.italica品种为‘法斯特’ (天津科润农业科技有限公司),于2019 年3 月24 日在北京市海淀区上庄镇试验田播种,采用大田小拱棚育苗,4 月11 日定植,双行高垅栽培。
供试仪器:岛津HPLC-MS 8050 高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪 (岛津有限公司)。
参照《农药田间药效试验准则》进行[18]。试验共设7 个处理:1) 32 000 IU/mg 苏云金芽孢杆菌可湿性粉剂 (Bt WP),1 312.5 g/hm2(推荐剂量);2) 32 000 IU/mg (Bt WP),656.3 g/hm2(50%推荐剂量);3) 10%虫螨腈悬浮剂,622.5 mL/hm2(推荐剂量);4) 10%虫螨腈悬浮剂,311.3 mL/hm2(50%推荐剂量);5) 32 000 IU/mg (Bt WP),656.3 g/hm2(50% 推荐剂量)+ 10% 虫螨腈悬浮剂,311.3 mL/hm2(50%推荐剂量);6) 3 倍10%虫螨腈悬浮剂,1 867.5 mL/hm2(300%推荐剂量);7) 空白对照:施用等量清水。
每个处理3 次重复,每小区面积约15 m2,每小区30 株西兰花,随机排列。于小菜蛾发生盛期,用手动喷雾器施药。各农药的使用剂量均采用其推荐剂量范围的中间值。喷施清水为对照。
采用等距取样法调查,每小区等距离取3 个点,每点6 株,共18 株,分别于药前调查虫口基数,药后1、3、7 d 及14 d 调查害虫死亡情况,根据公式 (1) 和 (2) 计算虫口减退率 (P) 和校正防效 (EC)。
式中,P为虫口减退率,%;NCK为药前活虫数;Nt为药后活虫数;EC为校正防效,%;Pt为处理组虫口减退率,%;PCK为对照组虫口减退率,%。
1.4.1 标准溶液的配制 准确称取虫螨腈标准品0.01 g (精确至0.1 mg) 于10 mL 容量瓶中,用乙腈溶解并定容,配成1 000 mg/L 的标准储备溶液。分别用西兰花花序提取液稀释,配成1、0.5、0.1、0.05 和0.01 mg/L 的基质匹配标准溶液。
1.4.2 样品的提取与净化 准确称取1.0 g (精确至0.01 g) 冷冻粉碎的样品于10 mL 离心管中,加入0.2 mL 水和3 mL 乙腈,涡旋提取2 min,加入0.5 g 氯化钠,涡旋提取1 min 后,于4 000 r/min下离心1 min。取1.0 mL 提取液,加入50 mg C18净化剂 (天津博纳艾杰尔公司) 涡旋30 s,静置后取上清液过0.22 μm 尼龙滤膜,待高效液相色谱-串联质谱 (HPLC-MS/MS) 检测分析。可根据需要使用对应的空白基质液进行进样前稀释。
1.4.3 仪器检测条件
色谱条件:Shim-pack GIST 色谱柱 (2.1 mm ×50 mm,1.8 μm,日本岛津公司);柱温40 ℃;流动相为V(乙腈) :V(水) = 80 : 20,流速为0.2 mL/min;进样量为2 μL。
质谱条件:电喷雾离子源 (ESI);离子源温度300 ℃,脱溶剂化管DL 温度250 ℃;加热块温度400 ℃;雾化气 (N2) 流速3 L/min;加热气 (N2)流速3 L/min;干燥气 (N2) 流速10 L/min;毛细管电压4 kV;扫描方式为负离子模式;多重反应监测模式 (MRM)。两个离子对的m/z及碰撞能分别为346.95 > 79.05(31 V) 及346.95 > 131.15(37 V),其中346.95 > 79.05(31 V) 为定量离子对。
1.4.4 检测方法的确证 在上述仪器条件下测定不同浓度基质匹配标准溶液的色谱峰面积,以基质匹配标准溶液的质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线。此外,在西兰花花序空白基质中,分别添加5.0 和0.050 mg/kg 两个水平的虫螨腈标准溶液,每个水平5 个重复,按1.4.2 节的方法进行样品前处理,用上述分析方法测定计算添加回收率及相对标准偏差 (RSD),以考察所建方法的准确度和精密度。根据添加回收试验,选择最小添加浓度作为方法的定量限 (LOQ) 并验证。
样品采集及处理:分别于施药后2 h 及1、3、5、7、10、14、21 d,采用5 点法取样,每个采样时间点采集两个重复,每个重复由5 个西兰花花序组成。对照仅采集施药后2 h 及14、21 d的西兰花样品。
将采集的西兰花花序样品,切碎,混匀,四分法缩分留样150 g 两份,于 -20 ℃保存,待测。
使用SPSS 22.0 软件进行单因素方差分析,用Waller-Duncan 法进行差异显著性检验。
由表1 可以看出,Bt 按推荐剂量施药后仅在药后3 d 和7 d 对小菜蛾具有一定的防控作用,而按50%推荐剂量施药后1~14 d 对小菜蛾的防效均低于40%,不能有效防控小菜蛾。虫螨腈按推荐剂量施药后1~7 d 内对小菜蛾具有一定的防控作用,而按50%推荐剂量施药后1~14 d 内对小菜蛾均不具有防控作用。由此可见,Bt 和虫螨腈单剂分别按推荐剂量施药后7 d 内对小菜蛾具有一定的防效,而按50%推荐剂量施药后在14 d 供试期内均不能对小菜蛾进行有效防控。
表1 两种杀虫剂不同处理对西兰花上小菜蛾的田间防效Table 1 The field efficacy of the different treatments of two insecticides against Plutella xylostella on Brassica oleracea var. italica
50% 推荐剂量的虫螨腈与50% 推荐剂量的Bt 混配使用,药后1~7 d 对小菜蛾的防效与推荐剂量虫螨腈单剂的防效间均无显著差异,但均显著超过了分别使用50%推荐剂量Bt 单剂及50%推荐剂量虫螨腈单剂的防效。同时,在药后3 d 也显著超过了推荐剂量Bt 单剂的防效。在药后14 d,各处理均不再具有防控作用,且均没有显著差异。因此,50%推荐剂量的Bt 与50%推荐剂量的虫螨腈混配使用,在药后1~7 d 对小菜蛾具有一定的防效,且具有一定的速效性和持效性。表明Bt与虫螨腈合理混配可以达到减量使用虫螨腈防控小菜蛾的目的,对于减少虫螨腈的污染,降低害虫抗药性发展的风险具有价值。
通常文献报道的虫螨腈残留均使用气相色谱-质谱方法检测[19-22]。本研究发现,虫螨腈经电离源电离后,掉落基团[CH2OCH2CH3]后,产生的母离子m/z为346.95 [M-CH2OCH2CH3]-。将母离子进一步碰撞电离后产生的两个子离子m/z分别为131.15 及79.05,因此可使用高效液相色谱-串联质谱法对虫螨腈进行定性定量分析。在所建立的HPLC-MS/MS 的分析条件下,分别测定空白西兰花花序样品、添加虫螨腈的西兰花花序中虫螨腈的残留。结果表明:多重离子检测条件对虫螨腈的特异性较好,样品基质均不干扰虫螨腈的检测,虫螨腈在西兰花花序基质中的线性相关性良好,标准曲线方程为y=123 300x+116.30,R2=0.998 0。LOQ 为0.050 mg/kg。在测定的浓度范围内,虫螨腈在空白西兰花花序基质中的回收率在95%~109%之间,RSD 均 ≤ 10%。表明所建方法具有良好的准确性和重复性,满足农药残留测定要求[23],可用于西兰花花序的虫螨腈残留检测。
澳大利亚和日本分别规定西兰花上虫螨腈的最大残留限量 (MRL) 为0.50 mg/kg[24]和3.0 mg/kg[25]。欧盟规定虫螨腈在西兰花上的临时限量为0.010 mg/kg[26]。我国规定虫螨腈在结球甘蓝上的MRL 值为1.0 mg/kg,在芥蓝上为0.10 mg/kg,在黄瓜上为0.50 mg/kg,目前还没有规定其在西兰花上的MRL 值。因此,本研究中采用了澳大利亚规定的虫螨腈在西兰花上的MRL 值0.50 mg/kg来评价其残留水平,但由于不同地区施药方式、膳食及消费等差异,其合理性有待商榷。
研究发现,经不同剂量的虫螨腈处理后,虫螨腈在西兰花上的残留消解动态有所不同,但均符合准一级反应动力学或一级反应动力学方程。推荐剂量的虫螨腈施药7 d 后,其在西兰花上的消解率为72%,残留量为0.14 mg/kg,已低于其在西兰花上的MRL 值 (0.50 mg/kg),21 d 时已低于LOQ (0.050 mg/kg)。
按50% 的推荐剂量施用虫螨腈单剂或混配施用后7 d,虫螨腈在西兰花上的残留量 (分别为0.083 mg/kg 和0.072 mg/kg) 已远低于虫螨腈在西兰花上的MRL 值,14 d 时已低于LOQ (0.050 mg/kg)。表明减量施用虫螨腈单剂及其与Bt 混配制剂,均可降低虫螨腈在西兰花上的残留风险。因此,可将减量50% 的虫螨腈与减量50% 的Bt 混配使用,既可以有效防治小菜蛾,又可以解决西兰花上虫螨腈残留超标的问题。
此外,为了研究超量使用虫螨腈对西兰花的残留风险,研究了按3 倍推荐剂量施用虫螨腈后对小菜蛾的防效及虫螨腈的残留消解动态。结果(表1 及表2) 表明,虽然3 倍剂量虫螨腈对小菜蛾的防效较好,但其残留消解速率显著减慢。施药后14 d 的残留量为0.27 mg/kg,明显高于其他处理的残留量。可见,农药过量使用会增加农产品的农药残留超标风险。
表2 虫螨腈在西兰花中的残留消解动态Table 2 Residue dissipation dynamics of chlorfenapyr in Brassica oleracea var. italica
小菜蛾作为蔬菜上的重要害虫,随着化学杀虫剂的大量使用,小菜蛾抗药性问题日益突出,对其防治的难度越来越大,同时会增加农产品质量和环境安全风险。因此,筛选安全高效的防治药剂与组合配方对小菜蛾防治和农产品的安全生产具有重要意义。
将Bt 与化学农药混配进行害虫防治,可以有效减少化学杀虫剂的使用量,从而减少农药残留对农产品和环境的污染,并延缓害虫抗药性的发展。Bt 与杀虫剂混配对害虫的防治作用已有很多研究报道。李玉奎等[27]研究表明,灭多威与Bt 混配对棉铃虫防治的持效期比灭多威单剂延长了3~5 d。付建红等[28]研究表明,Bt 与高效氯氰菊酯复配对棉铃虫的防治效果比两个单剂的累加防效高16.6%。姚经武[29]报道0.80%Bt 粉剂与减量80%的毒死蜱混配的可湿性粉剂,对斜纹夜蛾2 龄幼虫的共毒系数为184,具有明显的增效作用。宋健等[30]研究表明,Bt 与减量的噻虫胺、呋虫胺和虫螨腈分别混用,不仅杀虫速效性好,而且杀虫毒力均大幅提高,对韭蛆的防效表现出了明显的增效作用。本研究结果表明,50%推荐剂量虫螨腈与50%推荐剂量Bt 混配施用后,7 d 内的防效与推荐剂量的虫螨腈防效没有差异,但均显著超过了施用相同剂量的虫螨腈与Bt 单剂的防效,且在药后1 d 和3 d 均显著超过了施用推荐剂量Bt 单剂的防效。表明50%推荐剂量的虫螨腈与50%推荐剂量的Bt 混配使用具有减量增效的作用。
本研究中,减量50% 的虫螨腈和减量50%的Bt 混配施用,在药后1~7 d 对小菜蛾的防效较好,具有一定的速效性和持效性,这可能与化学农药和生物农药混配后仍然能够较好发挥各自的杀虫作用且杀虫活性作用能够互补有关。此外,有文献报道,小菜蛾对化学杀虫剂和Bt 杀虫蛋白没有交互抗性,且与Bt 混配可以延缓对化学杀虫剂抗药性的发展[31-32],因此,将Bt 与虫螨腈减量混配使用,对小菜蛾的抗性治理可能会具有一定的作用,但还需进一步研究证实。
本研究中,虽然各虫螨腈处理对西兰花上小菜蛾都具有一定的防效,但是防效均介于40%~70%之间,并不是非常高。这一方面可能是由于试验区内小菜蛾对虫螨腈产生了一定程度的抗药性,另一方面可能与西兰花的表面蜡质较厚,而本研究使用的是对环境相对友好的虫螨腈悬浮剂,因而可能导致药剂对西兰花的穿透性较差有关。张卫飞等[33]也报道施药后7 d 内虫螨腈对花椰菜上小菜蛾的防效低于60%。此外,虫螨腈和Bt 的混配比例也有可能影响对小菜蛾的防治效果,由于试验条件限制,本研究仅进行了虫螨腈与Bt 分别按50%推荐剂量混配的试验,对于其他混配比例是否存在较高防效尚待研究。因此,对于虫螨腈在西兰花上小菜蛾防治中药效不是十分突出的原因,还需进一步的探究。
有研究发现,农药剂型、用量等均会影响农药的残留及消解动态[34-35]。因此,明确虫螨腈在西兰花上的残留消解动态,可以为虫螨腈的安全使用及西兰花的安全生产提供科学依据。本研究表明,推荐剂量虫螨腈在西兰花上的半衰期为4.1 d,50%推荐剂量虫螨腈的半衰期为3.8 d,50%推荐剂量虫螨腈与Bt 混配剂的半衰期为4.2 d。这与文献报道的虫螨腈在青菜中的半衰期为4.3 d,在小白菜中半衰期为2.7~10.6 d一致[36-37]。此外,本研究发现,虫螨腈与Bt 分别减量50%后混配使用并未显著影响虫螨腈在西兰花上的残留消解动态,但有效降低了虫螨腈在西兰花上的原始沉积量,且随着时间的延长,残留量也显著降低。这与阿维菌素、乙霉威和腐霉利在黄瓜上的研究结果一致[34-35]。因此,虫螨腈与Bt 通过减量混配使用,可以达到减量增效、降低西兰花上虫螨腈残留的目的。
综上,虫螨腈与Bt 合理混配用于防治西兰花上的小菜蛾,不仅可以减少虫螨腈的用量,降低其残留,减缓害虫的抗药性发展,还可以弥补生物农药制剂Bt 药效发挥受环境影响大的缺点,从而达到减药防治小菜蛾、实现西兰花安全生产的目的,具有一定的应用前景。