不同基质和覆土栽培条件下双孢蘑菇中吡虫啉和咪鲜胺残留差异影响

郭燕云, 陈珊珊, 张其才, 饶钦雄, 王献礼, 程 琳, 宋卫国*,

(1. 上海海洋大学 食品学院，上海 201306；2. 上海市农业科学院 农产品质量标准与检测技术研究所，上海 201403)

近年来，食用菌产量和食用菌进出口贸易额逐年增加，年产量超过 3 400 万 吨，为中国农业经济增长做出了重大贡献[1-2]。但食用菌在生产过程中的农药残留问题仍然没有得到解决，不仅给人类及动植物带来健康风险，同时也给食用菌进出口贸易带来严重影响[3-4]。农药施用后会残留在食用菌覆土和培养料中，再通过生物富集在食用菌子实体中残留[5-7]，刘烨潼等[8]对天津市售 5 种食用菌抽样检测发现，农药残留总体合格率为 92.3 %，其中双孢蘑菇的合格率为76.9%，相比于香菇(100 %)、平菇 (90.6 %)、白灵菇 (96.7 %)和金针菇 (100 %)，双孢蘑菇质量问题更为突出。

双孢蘑菇Agaricus bisporus是一种草腐型食用菌，目前在全球范围内广泛栽培，近年来双孢蘑菇工厂化栽培发展势头强劲[9]。常规栽培中使用稻秸秆、麦秸秆等作为培养料，泥炭土、田园土等作为覆土材料，也可在泥炭土中加入一定比例的草木灰、椰糠、废弃菌渣等材料提高双孢蘑菇产量[10-14]。双孢蘑菇生产中覆土和培养料构成稍有差异，覆土有机碳含量不同，稻秸秆和麦秸秆组成比例也不同[15-17]。研究表明，有机碳含量和pH值均会影响双孢蘑菇栽培过程中农药的富集和降解[18-20]，关于双孢蘑菇的覆土性质和培养料原料种类对农药的残留消解有何影响、如何影响，尚未见报道。欧盟 (EU) 规定吡虫啉在栽培真菌中的最大残留限量 (MRL) 为 0.05 mg/kg，中国尚未制定吡虫啉在食用菌中的 MRL[21]。中国规定鲜蘑菇中咪鲜胺的MRL 值为2 mg/kg[22]，日本规定咪鲜胺在双孢蘑菇中的MRL 值为2 mg/kg[23]，欧盟规定其在栽培真菌和野生菌中的 MRL 值分别为3 mg/kg 和 0.05 mg/kg[21]。综上，本研究选取常用的代表性覆土材料——泥炭土并添加草木灰和椰糠，并基于稻/麦秸秆两种比例的培养料，研究了吡虫啉和咪鲜胺在不同栽培基质中的消解动态，旨在为双孢蘑菇生产中农药的安全使用及风险评估提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 药剂、试剂与仪器

吡虫啉标准品 (imidacloprid，纯度 99.5%，德国Dr.Ehrenstorfer 公司)；咪鲜胺标准品 (prochloraz，100 μg/mL，溶剂为甲醇，天津阿尔塔科技有限公司) ；80%吡虫啉水分散粒剂 (80% imidacloprid WG，天津市华宇农药有限公司)；50 % 咪鲜胺锰盐可湿性粉剂 (50% prochloraz manganese salt WP，上海生农生化制品股份有限公司)；乙腈和甲醇(HPLC 级，德国 Merck 公司)；氯化钠 (分析纯，上海埃彼化学试剂有限公司)；乙酸铵和甲酸均为色谱纯 (纯度 ≥99.0 %，上海安谱实验科技股份有限公司)；WondaPakQuEChERS 柠檬酸盐提取试剂包 (4 g 硫酸镁，1 g 氯化钠，0.5 g 柠檬酸氢二钠，1 g 柠檬酸钠，日本岛津公司)。

ACQUITY UPLC 超高效液相色谱仪 (美国Waters 公司)；AB 5500 型三重四极杆质谱仪 (美国 ABSCIEX 公司)；MX-S 涡旋仪 (美国赛洛捷克公司)；ADV 230 数显型涡旋混合器 (美国 Henry Troemner 公司)；D-37520 冷冻离心机 (美国 Thermo公司)；CQ-250-DST 型超声波清洗器 (上海跃进医用光学器械厂)；HWS-250 电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；Ultra 系列超纯水仪 (上海首立实业有限公司)；N-EVAP-12 氮吹仪(美国Organomation 公司)；CM230 L 手推式搅拌机 (巩义市吴军机械厂)；PB936 奥克斯食品料理机 (中山市欧麦斯电器有限公司)；S220-K 型手持式pH 计 (梅特勒-托利多仪器上海有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 试验地点与条件 田间试验地点设在上海联中食用菌专业合作社，供试双孢蘑菇Agaricusbisporus菌种为美国 A15 (由上海联中食用菌专业合作社提供)，室内试验设在上海市农科院质标所实验室。以6 m × 1.35 m 的床架为1 个小区，2 m ×1.35 m 的区域为试验单位，小区间设隔离带，设置3 个重复。覆土和培养料的组成同文献方法[17]。培养料发酵与出菇栽培过程同文献方法[24]。

1.2.2 不同覆土和培养料理化性质 常规覆土和椰糠土中的有机碳、有机质含量较高，草木灰土pH 值较高，这是由于草木灰本身呈碱性，添加到覆土中导致覆土pH 值升高。3 种覆土的含水量基本保持一致。两种培养料的有机碳、有机质含量、pH 值和含水量基本保持一致 (表1)。

表1 不同覆土和培养料理化特性Table 1 Physico-chemical properties of different casing soil and composts

1.2.3 试验方法

1.2.3.1 施药剂量 根据吡虫啉、咪鲜胺在其他农作物上的推荐剂量，本研究中以推荐剂量的3 倍作为施药剂量，即80 % 吡虫啉水分散粒剂用量1.5 g/m2，50 % 咪鲜胺锰盐可湿性粉剂用量为7.2 g/m2。

覆土：每个试验单位2 m × 1.35 m 的床架，80 %吡虫啉水分散粒剂4.05 g，50 % 咪鲜胺锰盐可湿性粉剂19.44 g，添加1 L 自来水，配制成药液。

培养料：每个试验单位2 m × 1.35 m 的床架，80 %吡虫啉水分散粒剂为0.81 g，50 % 咪鲜胺锰盐可湿性粉剂为3.89 g (由于培养料采取喷雾施药方式，施药剂量约为覆土的1/5)，添加200 mL自来水，配制成药液。

1.2.3.2 农药在不同覆土中消解试验 采用一次施药多次采样的方法，设置3 个处理：常规覆土(ST1)、草木灰土 (ST2，常规覆土添加20 %草木灰)、椰糠土 (ST3，常规覆土添加20 % 椰糠)。ST1 处理时，每个试验单位2 m × 1.35 m 的床架称取准备好的常规覆土85 kg 置于手推式搅拌机中，边搅拌边喷雾加入已配好的药液，然后将拌好的覆土覆盖到3 次发酵培养料的床架上。ST2、ST3 处理中，称取64 kg 原土、17 kg 草木灰/椰糠、4 kg 自来水 (调整覆土含水量使其一致)，同样采用边搅拌边喷雾施药，将覆土覆盖到培养料上。不同覆土试验中使用的培养料均为3 次发酵培养料 (52%小麦秸秆、39.3%鸡粪、1.6%棉籽壳、2.3%棉籽饼和4.8%石膏)，由上海联中食用菌专业合作社提供。另设不添加农药的空白覆土对照 (CK1)。

1.2.3.3 农药在不同培养料中消解试验 试验设置两个稻秸秆/麦秸秆配比的培养料，分别为m(稻秸秆) :m(麦秸秆)=0 : 10 (CT1)、2 : 8 (CT2)，由上海联中食用菌专业合作社提供，将药液采用喷雾方式均匀喷洒在3 次发酵培养料表面，再覆盖上空白覆土。另设不添加农药的空白培养料对照(CK2)。

1.2.3.4 采样方法 采用五点采样法，分别在施药后2 h 及1、3、5、7、10、20、30、40、50 d 采样，分别采集覆土和培养料各200 g (培养料采样时将覆土与培养料接触部分去除，以防止混入的覆土颗粒影响试验结果) 及空白样品，于真空冷冻干燥机中干燥72 h，用粉碎机打成粉末，于-20 ℃保存，备用。每潮双孢蘑菇直径长至 5 cm 左右 (即26 d、35 d、45 d) 时采摘各500 g，去除根部，尽量不带覆土，用料理机将子实体匀浆，于 -20 ℃保存，备用。

1.3 分析方法

1.3.1 样品前处理 参考Zhang 等的方法[25]。分别称取2 g 双孢蘑菇覆土、培养料或子实体 (10 g)样品于 50 mL 塑料离心管中，加入10 mL 超纯水浸泡 10 min (其中双孢蘑菇子实体样品无需加水)后加入 10 mL 乙腈，手动涡旋提取 2 min，超声提取 10 min；加入柠檬酸盐提取盐试剂包，振荡1 min，于 5 000 r/min 下离心5 min；取上清液1 mL 于试管中，加入 1 mL 超纯水，过 0.22 μm有机滤膜，待测。

1.3.2 仪器检测条件

色谱条件：Waters BEH C18色谱柱 (2.1 mm ×100 mm，1.7 μm)；流速 0.4 mL/min，流动相 A 为甲醇，B 为 5 mmol/L 乙酸铵。梯度洗脱程序：5%A 开始，保持1.5 min；＞1.5～4.5 min，从5% A 增加到95 % A；＞4.5～5.5 min，由95 % A 降至5% A；5% A 保持1 min。进样量 2 μL，柱温 30 ℃。

质谱条件：电喷雾离子源正离子扫描 (ESI+)；多反应监测模式 (MRM)，离子化电压为 5 kV；温度 500 ℃；喷雾气流速 55 μL/min；气帘气流速35 μL/min；吡虫啉定量离子对m/z256/175.1，定性离子对m/z256/209；咪鲜胺定量离子对m/z376.1/308，定性离子对m/z376.1/70.1。

1.3.3 标准溶液配制及标准曲线绘制 准确称取吡虫啉 0.01 g 标准品，用甲醇溶解，配成100 mg/kg的标准溶液，于-20 ℃保存，待用。将吡虫啉和咪鲜胺标准溶液用甲醇分别稀释成 0.005、0.05、0.1、0.5 和1 mg/L 系列标准溶液，按1.3.2 节的条件测定，分别以吡虫啉和咪鲜胺的质量浓度为横坐标，离子峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.4 添加回收试验 根据预试验结果，分别向空白覆土、培养料或子实体提取液中添加0.02、0.1 和1 mg/L 3 个水平的吡虫啉和咪鲜胺标准溶液, 每个水平重复 5 次。按1.3.1 节的方法进行样品前处理，按1.3.2 节的条件测定，计算添加回收率及相对标准偏差。

1.3.5 基质效应 通过溶剂标准曲线斜率及基质标准曲线斜率的比值计算基质效应 (Me)。当Me介于0.8～1.2 时，基质干扰程度较低[26]。

2 结果分析

2.1 线性范围、添加回收率、相对标准偏差及基质效应

在 0.005 ～ 1 mg/L 范围内，吡虫啉和咪鲜胺的质量浓度与各自对应的峰面积间呈良好的线性关系。线性方程为吡虫啉y= 2.40 × 106x+ 1.22 × 104，R2= 0.999 7；咪鲜胺y= 9.83 × 105x+ 9.22 × 103，R2= 0.999 8。以3 倍信噪比计算检出限 (LOD)，以10 倍信噪比计算定量限 (LOQ)，结果见表2。

添加回收试验测定结果表明，在 0.02 ～ 1 mg/L添加水平下，吡虫啉和咪鲜胺在覆土、培养料和双孢蘑菇子实体3 种基质中的平均回收率为 78% ～94 %，相对标准偏差 (RSD) 为 1.6 % ～ 13 % (表2)，符合农药残留分析的要求[27]。

表2 吡虫啉和咪鲜胺在覆土、培养料和子实体中的平均添加回收率、相对标准偏差、检出限和定量限 (n = 5)Table 2 Average recoveries, RSDs, LOD and LOQ of imidacloprid and prochloraz in casing soil,compost and fruiting body(n = 5)

在本试验条件下，吡虫啉在覆土、培养料和双孢蘑菇子实体中的基质效应分别为0.96、0.95 和0.98，咪鲜胺在覆土、培养料和双孢蘑菇子实体中的基质效应分别为0.98、0.99 和1.03，两种农药的基质效应均在 0.8 ～ 1.2 之间，可忽略不计，因此本研究采用溶剂标准溶液进行外标法定量。

2.2 吡虫啉、咪鲜胺在覆土中的消解动态

2.2.1 吡虫啉在覆土中的消解动态 由图1 可知：随着施药后时间的增加，吡虫啉在3 种覆土中的残留量呈明显的下降趋势，消解动态符合一级反应动力学方程 (表3)。覆土中有机碳含量与吡虫啉消解速率呈负相关，随着有机碳含量的增加，半衰期变长。草木灰土的有机碳含量低于常规覆土和椰糠土，而半衰期最短，说明pH 值也对吡虫啉在双孢蘑菇覆土中的消解有较大影响，各因素之间是否有协同或拮抗作用仍需进一步研究。

表3 吡虫啉和咪鲜胺在3 种覆土中的消解动态Table 3 Dissipation dynamics of imidacloprid and prochloraz in three casing soil

2.2.2 咪鲜胺在覆土中的消解动态 由图1 可知：咪鲜胺在常规覆土、草木灰土、椰糠土3 种覆土的消解规律跟吡虫啉相似，但与吡虫啉相比，咪鲜胺在这3 种覆土中消解更快。

总体来看，草木灰和椰糠的加入均会加快吡虫啉和咪鲜胺的消解，且消解速率与覆土的有机碳含量、酸碱度有关，其中pH 值对其在双孢蘑菇覆土中的消解有较大影响。

2.3 吡虫啉、咪鲜胺在培养料中的消解动态

2.3.1 吡虫啉在培养料中的消解动态 由图2 可知：吡虫啉全麦草培养料 [m(稻秸秆) :m(麦秸秆)=0 : 10] 中的初始残留量为157.9 mg/kg，50 d的残留量为1.6 mg/kg，半衰期为7.7 d；而在20 %稻秸秆 [m(稻秸秆) :m(麦秸秆) =2 : 8] 的培养料中的初始残留量为139.1 mg/kg，50 d 的残留量为1.7 mg/kg，半衰期为8.0 d (表4)。与全麦草配方相比，吡虫啉在20 %稻秸秆配方中消解得更慢，这可能是由于稻麦秸秆本身物理结构不同，稻秸秆更容易板结，培养料通气性变差，抑制了与农药降解有关的酶的活性[28]，从而使得吡虫啉在培养料中半衰期变长。

2.3.2 咪鲜胺在培养料中的消解动态 由图2 可知：咪鲜胺在两种培养料中的消解规律与吡虫啉相似。在全麦草培养料中50 d 的消解率为97 %，半衰期为10.9 d，而在20%稻秸秆培养料中50 d的消解率为88.6 %，半衰期为 12.8 d (表4)。

表4 吡虫啉和咪鲜胺在两种培养料中的消解动态Table 4 Dissipation dynamics of imidacloprid and prochloraz in two composts

总体看来，全麦草培养料中吡虫啉和咪鲜胺的消解速率更快，从农药消解角度来看，实际生产中选用全麦草培养料优于20 %稻秸秆培养料。

综上，吡虫啉和咪鲜胺在培养料中的消解率明显高于覆土，在培养料中属于易消解的农药 (t1/2＜30 d)，并且吡虫啉或咪鲜胺在两种培养料中的消解均表现为在全麦草中的半衰期长于在20%稻秸秆中的，这也以说明培养料中农药的消解可能与稻/麦秸秆的物理结构有关。

2.4 不同栽培基质对双孢蘑菇子实体中吡虫啉、咪鲜胺残留的影响

结果 (表5) 表明：在不同覆土处理下，两种农药在双孢蘑菇3 潮次菇中均有检出，且在常规覆土处理的子实体中的残留量均高于在草木灰土和椰糠土中的。覆土中的农药会向双孢蘑菇中迁移，草木灰土和椰糠土处理中吡虫啉在双孢蘑菇子实体中的残留量显著降低，草木灰土处理中咪鲜胺在双孢蘑菇子实体中的残留量显著降低。

表5 两种农药在不同覆土和培养料栽培的双孢蘑菇中的残留量Table 5 Residues of two pesticides in Agaricus bisporus cultivated with different casing soil and composts

在不同培养料处理下，两种农药在全麦草处理的子实体中残留量均低于20%稻秸秆中的，说明半衰期较长的处理，最终双孢蘑菇子实体中残留量也较大。同一处理不同潮次子实体内的农药残留有所不同，第二潮次吡虫啉残留最低，咪鲜胺残留量最高。但这种变化并不呈现明显的规律性，可能跟采摘、栽培措施、菇体大小等有关。

3 结论与讨论

本研究报道了吡虫啉和咪鲜胺在双孢蘑菇3 种覆土和两种培养料中的消解规律，采用超高效液相色谱-串联质谱 (UPLC-MS/MS) 法测定了农药在覆土和培养料中不同时间段的残留量。结果表明，在0.005 ～ 1 mg/L 范围内，两种农药的质量浓度与峰面积间呈良好的线性关系 (R2＞ 0.99)，在0.02、0.1 和1 mg/L 3 个添加水平下，吡虫啉和咪鲜胺在覆土、培养料和双孢蘑菇3 种基质中的回收率为78%～94%，RSD 为 1.6% ～ 13%，检出限均为 0.0001～0.002 mg/L，均满足农药残留分析的要求。

在不同栽培基质中，吡虫啉和咪鲜胺的消解规律均符合一级反应动力学方程。消解半衰期均表现为：覆土中常规覆土 ＞ 椰糠土 ＞ 草木灰土，培养料中m(稻秸秆) :m(麦秸秆) = 2 : 8 ＞m(稻秸秆) :m(麦秸秆) = 0 : 10。这可能与农药本身的性质有关。研究表明，土壤中有机质有利于农药的降解[29]。农药消解速率与覆土酸碱性也有相关性，特别是碱性条件下吡虫啉因为易水解而消解变快[30]。吡虫啉和咪鲜胺本身在碱性条件下易水解[29]，当pH = 11 时，咪鲜胺在不同缓冲溶液中的水解速率较快[31]。而且，pH 值对土壤空隙中发生的反应有较大影响，其效果取决于反应是碱催化还是酸催化，温度、湿度、根际分泌物、土壤粒径等因素也会对农药残留消解造成影响[32]。而草木灰土的pH 值为9.28，可能导致添加草木灰覆土中农药消解较快，50 d 的消解率达到85.6 %。此外，栽培基质中有机碳含量也会影响农药的消解，同种农药在有机质含量高的土壤中移动速率更快[33]，有机碳含量高会提高农药的吸附和消解能力[34]，使半衰期缩短。吡虫啉和咪鲜胺在培养料中的消解速率快于覆土，这与前期其他农药的消解规律一致[7]。

吡虫啉残留物定义为吡虫啉及其衍生物含有6-氯-吡啶基的代谢物，咪鲜胺残留物定义为咪鲜胺及其含有2,4,6-三氯苯酚结构的代谢物[35]。本研究中分析了母体化合物在双孢蘑菇及栽培基质中的消解动态，但缺少对其代谢物的分析。根据前期研究[22]，覆土中吡虫啉代谢物吡虫啉脲、6-氯烟酸、吡虫啉烯烃的总量与亲本吡虫啉相比不超过2.4%。有研究表明，土壤中吡虫啉代谢物的总和从未超过6%，母体化合物在土壤中始终是主要成分[36]。因此，吡虫啉母体化合物消解速率在总残留物消解中占据主导作用，但仍需要关注培养料和覆土变化对代谢物及其含量的影响。咪鲜胺最终代谢物为2,4,6-三氯苯酚，有研究发现在蘑菇土壤中2,4,6-三氯苯酚的残留量随时间呈现增长的趋势，其代谢物含量未超5 %[37]。因此本研究未对咪鲜胺代谢物2,4,6-三氯苯酚进行测定，母体化合物消解一定程度上反映了培养料和覆土对咪鲜胺残留消解的影响，然而需要进一步研究代谢物变化对总体残留量的改变，以更准确地反映双孢蘑菇栽培基质对咪鲜胺残留的影响。在本研究栽培基质模拟试验中，环境条件 (温度和湿度) 基本保持一致，主要的影响因素为基质有机质含量、组分、pH 值等各因素，但仍需要更深入研究确定主导因素及相关影响机理，从理论上进一步揭示栽培基质对农药残留的改变规律，为合理选择培养基配方、科学合理施用农药和降低农药残留风险提供理论支持。