吡唑并嘧啶衍生物的设计、合成、杀虫活性及其与γ-氨基丁酸受体的结合模式

栗广龙, 江卓媛, 周 聪, 须志平, 李 忠, 程家高

(华东理工大学 药学院，上海市化学生物学 (芳香杂环) 重点实验室，上海 200237)

氟虫腈 (fipronil)[1]等苯基吡唑类杀虫剂，广泛应用于作物保护及卫生害虫的防治[2]，且对哺乳动物安全[3-4]，一直是杀虫剂研究领域的热点之一[5-8]。自氟虫腈上市以来，乙虫腈 (ethiprole)、氟吡唑虫 (vaniliprole)、啶吡唑虫胺 (pyrafluprole)、吡唑虫啶 (pyriprole) 以及丁烯氟虫腈 (flufiprole) 等苯基吡唑杀虫剂[7]陆续上市。

随着氟虫腈被广泛使用，害虫对其产生抗性[9]及其对蜜蜂[10-11]、鱼类[12-13]等非靶标生物的毒性问题凸显。因氟虫腈对鱼类高毒，中国自2009 年10 月1 日起，已停止销售和使用除卫生用及用于玉米等部分旱田种子包衣剂外的含氟虫腈成分的农药制剂[14]。苯基吡唑类杀虫剂[15]作用于昆虫γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA) 受体，通过阻塞TM2 跨膜螺旋围成的通道[16]抑制氯离子内流，最终引起害虫过度兴奋而导致死亡[17-18]。氟虫腈对鱼类高毒的原因在于其可以与鱼类GABA 受体高度结合，其中氟虫腈中的氨基与GABA 受体的6’Thr间形成的氢键起到关键作用[19-20]。在氟虫腈的低能构象中，氨基氢原子与亚砜氧原子形成了N－H···O 的分子内氢键[21]。本课题组在之前的研究中，曾以脂肪环模拟氟虫腈分子内氢键，得到的化合物对小菜蛾有杀虫活性，如化合物D10 在100 mg/L下对小菜蛾的致死率为62.5% (图1)[22]。

基于氟虫腈结构，本研究采用芳香环模拟氟虫腈分子内氢键，开展了基于骨架跃迁策略的分子设计 (图1)，合成了25 个未见报道的苯基吡唑并嘧啶胺 (A1～A8) 和苯基吡唑并嘧啶酮 (B1～B17) 两个系列化合物，合成路线分别见图式1 和图式2；同时开展理化性质预测、杀虫活性测试以及与GABA受体结合模式研究，以期发现高杀虫活性化合物。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Bruker AM-400 核磁共振仪 (内标：TMS，氘代试剂：DMSO-d6或CDCl3)；电喷雾 (ESI)-高分辨飞行时间质谱仪 (Xevo G2 TOF MS)；电子轰击(EI)-高分辨飞行时间质谱仪 (GCT Premier)；Büchi Melting Point B-540 熔点仪；Bruker APEX-II CCD 单晶X 射线衍射仪等。除特殊说明外，实验中所用的试剂均为市售分析纯。

1.2 化合物合成

1.2.1 中间体2、4、5、7、9～11 的合成 中间体2 参考文献[23]的方法合成：将24.8 g 1,2,3-三氯-5-(三氟甲基) 苯 (1) 加入350 mL 耐压瓶中，加入150 mL 吡啶和37.5 g 80%水合肼，体系密封后置于油浴锅中，逐渐升温至150 ℃并搅拌12 h，降温至室温后，缓慢拧开瓶塞，薄层层析[TLC，V(正庚烷) :V(乙酸乙酯) =2 : 1] 监测至反应完成后，旋转蒸发除去吡啶，得黏稠油状物。加入100 mL 水，有大量固体析出，抽滤，得淡黄色固体18.5 g，收率76%，m.p. 52.3～53.4 ℃。

中间体4 参考文献[24]的方法合成，并以硅胶柱层析 [V(正庚烷) :V(乙酸乙酯) = 4 : 1] 提纯，得黄色固体，收率78%，m.p. 107.5～109.3 ℃。

中间体5 的合成：在25 mL 圆底瓶中加入1 035 mg 中间体4 和10 mL 原甲酸三乙酯，于120 ℃下反应，TLC [V(正庚烷) :V(乙酸乙酯) =4 : 1) 监测至反应完成。静置，降温至室温，有大量白色固体析出，抽滤，干燥，得白色絮状物758 mg，收率63%。

化合物5：m.p. 185.1～185.9 ℃。1H NMR (400 MHz,CDCl3),δ: 8.51 (s, 1H), 7.77 (s, 2H), 4.18 (q,J= 7.1 Hz, 2H),1.28 (t,J= 7.1 Hz, 3H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3),δ:162.58, 152.72, 135.69, 135.31, 134.61 (q,2JCF= 34.5 Hz),129.00, 125.88 (q,3JCF= 3.6 Hz), 121.91 (q,1JCF= 272.2 Hz),110.63, 110.40, 84.89, 65.34, 13.51。HRMS (EI):C15H8N5OF335Cl2(M+), 计算值401.005 8, 测试值401.005 9;C15H8N5OF335Cl37Cl (M+), 计算值403.002 9, 测试值403.003 2;C15H8N5OF337Cl2(M+), 计算值404.999 9, 测试值405.000 5。

中间体7 参照文献[24]的方法合成，硅胶柱层析 [V(正庚烷) :V(乙酸乙酯) = 3 : 1] 提纯，得白色粉末，收率65%，m.p.154.9～156.3 ℃。

中间体9 参照文献[25]的方法合成，硅胶柱层析 [V(正庚烷) :V(乙酸乙酯) = 3 : 1] 提纯，得白色粉末，收率72%，m.p. 140.6～142.1 ℃。

中间体10 的合成：于25 mL 圆底瓶中加入1.1 g 中间体9 和10 mL 原甲酸三乙酯，120 ℃下反应，TLC [V(正庚烷) :V(乙酸乙酯) = 5 : 1] 监测反应完成。静置，降温至室温，旋转蒸发脱去溶剂。硅胶柱层析 [V(正庚烷) :V(乙酸乙酯)= 4 : 1]纯化，得淡黄色固体0.9 g，收率78%。

化合物10：m.p. 80.0～81.1 ℃。1H NMR (400 MHz,CDCl3),δ: 8.56 (s, 1H), 8.11 (s, 1H), 7.71 (s, 2H), 4.30 (q,J=7.1 Hz, 2H), 4.11 (q,J= 7.1 Hz, 2H), 1.36 (t,J= 7.1 Hz, 3H),1.21 (t,J= 7.1 Hz, 3H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3),δ:163.27, 162.75, 150.45, 143.93, 137.46, 136.15, 133.23 (q,2JCF= 34.1 Hz), 125.46 (q,3JCF= 3.7 Hz), 122.22 (q,1JCF=271.8 Hz), 102.12, 63.41, 60.23, 14.33, 13.64。HRMS (EI):C16H14N3O3F335Cl2(M+), 计算值423.036 4, 测试值423.036 8;C16H14N3O3F335Cl37Cl (M+), 计算值425.033 5, 测试值425.033 8;C16H14N3O3F337Cl2(M+), 计算值427.030 5, 测试值427.031 4。

中间体11 参照文献[26]的方法合成。反应结束后，将反应液倒入冰水中，有大量固体析出，抽滤，干燥得白色粉末，收率71%，m.p. 234.7～236.0 ℃。

1.2.2 目标化合物A1 的合成 于25 mL 圆底瓶中加入401 mg 中间体5 和5 mL 甲醇，冰浴搅拌下滴加2 mL 氨水，有固体析出。滴加完毕后继续在冰浴下搅拌，TLC [V(正庚烷) :V(乙酸乙酯) =1 : 1] 监测反应至结束。抽滤，甲醇洗涤，得白色固体242 mg，收率65%。

4-氨基-1-(2,6-二氯-4-(三氟甲基) 苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-腈 (A1)：m.p. 244.8～246.0 ℃。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6),δ: 8.37 (s, 2H), 8.35 (s, 1H), 7.74 (s, 2H)。13C NMR (101 MHz, DMSO-d6),δ: 158.40, 157.17, 155.04, 135.37,134.96, 133.29 (q,2JCF= 33.5 Hz), 126.65 (q,3JCF= 3.2 Hz), 122.13(q,1JCF= 272.5 Hz), 119.53, 112.14, 100.32。HRMS (ESI):C13H635Cl2F3N6(M+H)+, 计算值372.998 3, 测试值372.999 4;C13H635Cl37ClF3N6(M+H)+, 计算值374.995 4, 测试值374.996 7;C13H637Cl2F3N6(M+H)+, 计算值376.992 4, 测试值376.991 2。

1.2.3 目标化合物A2 的合成 参考文献[27]的方法合成。将6.4 g 中间体7 加入100 mL 圆底瓶中，室温搅拌下加入40 mL 甲酰胺，逐渐升温至200 ℃，TLC [V(正庚烷) :V(乙酸乙酯) = 2 : 1] 监测至反应结束。冷却至室温，将反应液倒入100 mL冰水中，抽滤，干燥，得灰白色固体5.3 g，收率76%。

1-(2,6-二氯-4-(三氟甲基) 苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺 (A2)：m.p. 230.7～232.1 ℃。1H NMR (400 MHz,CDCl3),δ: 8.44 (s, 1H), 8.26 (s, 1H), 7.81 (s, 2H), 5.81 (s,2H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3),δ:157.62, 156.97, 155.14,136.56, 136.40, 133.76, 133.74 (q,2JCF= 34.1 Hz), 125.98 (q,3JCF= 3.7 Hz), 122.20 (q,1JCF= 271.8 Hz), 100.55。HRMS (EI):C12H6N5F335Cl2(M+), 计算值346.995 2, 测试值346.994 9;C12H6N5F335Cl37Cl (M+), 计算值348.992 3, 测试值348.992 6;C12H6N5F337Cl2(M+), 计算值350.989 3, 测试值350.989 8。

1.2.4 目标化合物A3～A6 的合成 将0.5 mmol 化合物A2 置于干燥的两口瓶中，在氩气保护及冰浴下注射加入3 mL 无水1,2-二氯乙烷 (DCE) 和1.5 mmol 三乙胺，滴加0.6 mmol 酰氯溶于1 mL无水DCE 的溶液，滴加完毕后升温至回流，TLC[V(二氯甲烷) :V(甲醇) = 10 : 1] 监测至反应完成。用DCM (10 mL × 3) 萃取。合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发除去溶剂，经硅胶柱层析 [V(二氯甲烷) :V(甲醇) = 10 : 1] 提纯，得到目标化合物A3～A6。

N-(1-(2,6-二氯-4-(三氟甲基) 苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基) 乙酰胺 (A3)：白色固体142 mg，收率73%，m.p. 150.3～150.5 ℃。1H NMR (400 MHz, CDCl3),δ: 9.24 (s,1H), 9.02 (s, 1H), 8.64 (s, 1H), 7.82 (s, 2H), 2.41 (s, 3H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3),δ: 168.60, 156.03, 155.35, 151.87,139.91, 136.58, 136.18,133.85 (q,2JCF= 34.2 Hz), 125.98 (q,3JCF= 3.6 Hz), 122.17 (q,1JCF= 271.9 Hz), 103.92, 24.53。HRMS (EI): C14H8N5OF335Cl2(M+), 计算值389.005 8, 测试值389.005 4; C14H8N5OF335Cl37Cl (M+), 计算值391.002 9, 测试值391.003 3; C14H8N5OF337Cl2(M+), 计算值392.999 9, 测试值393.000 5。

N-(1-(2,6-二氯-4-(三氟甲基) 苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基) 丙酰胺 (A4)：白色固体161 mg，收率80%，m.p. 147.5～148.1 ℃。1H NMR (400 MHz, CDCl3),δ: 8.97 (s,1H), 8.86 (s, 1H), 8.55 (s, 1H), 7.72 (s, 2H), 2.55 (q,J= 7.5 Hz, 2H), 1.26 (t,J= 7.5 Hz, 3H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3),δ: 172.16, 156.06, 155.46, 151.85, 139.96,136.60, 136.22, 133.83 (q,2JCF= 34.2 Hz), 125.97 (q,3JCF=3.7 Hz), 122.19 (q,1JCF= 271.9 Hz), 103.86, 30.58, 9.00。HRMS (EI): C15H10N5OF335Cl2(M+), 计算值403.021 5, 测试值403.021 0; C15H10N5OF335Cl37Cl (M+), 计算值405.018 5, 测试值405.019 0; C15H10N5OF337Cl2(M+), 计算值407.015 6, 测试值407.015 7。

N-(1-(2,6-二氯-4-(三氟甲基) 苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基) 丁酰胺 (A5)：白色固体161 mg，收率77%，m.p. 141.2～141.9 ℃。1H NMR (400 MHz, CDCl3),δ: 9.05 (s,1H), 8.64 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 7.82 (s, 2H), 2.58 (t,J= 7.4 Hz,2H), 1.92-1.83 (m, 2H), 1.10 (t,J= 7.4 Hz, 3H)。13C NMR(101 MHz, CDCl3),δ: 171.24, 156.08, 155.57, 151.65, 139.90,136.61, 136.25, 133.82 (q,2JCF= 34.1 Hz), 125.98 (q,3JCF=3.7 Hz), 122.20 (q,1JCF= 272.1 Hz), 103.83, 39.32, 18.53,13.64。HRMS (EI): C16H12N5OF335Cl2(M+), 计算值417.037 1,测试值417.036 9; C16H12N5OF335Cl37Cl (M+), 计算值419.034 2,测试值419.034 0; C16H12N5OF337Cl2(M+), 计算值421.031 2，测试值421.030 4。

N-(1-(2,6-二氯-4-(三氟甲基) 苯基)-1H-吡唑并[3,4-d] 嘧啶-4-基) 异丁酰胺 (A6)：白色固体173 mg，收率83%，m.p. 141.5～143.1 ℃。1H NMR (400 MHz, CDCl3),δ:8.99 (s, 1H), 8.67 (s, 1H), 8.55 (s, 1H), 7.73 (s, 2H), 2.72-2.65 (m,1H), 1.29 (d,J= 6.9 Hz, 6H)。13C NMR (101 MHz,CDCl3),δ: 175.63, 156.02, 155.39, 152.17, 140.12, 136.60,136.20, 133.81 (q,2JCF= 34.2 Hz), 125.96 (q,3JCF= 3.6 Hz),122.17 (q,1JCF= 272.0 Hz), 103.98, 36.45, 19.25。HRMS(EI): C16H12N5OF335Cl2(M+), 计算值417.037 1, 测试值417.037 2;C16H12N5OF335Cl37Cl (M+), 计算值419.034 2, 测试值419.034 6; C16H12N5OF337Cl2(M+), 计算值421.031 2, 测试值421.031 6。

1.2.5 目标化合物A7～A8 的合成 将1 044 mg A2置于25 mL 圆底瓶中，加入10 mL 原甲酸三甲酯或原甲酸三乙酯，升温至回流，TLC [V(正庚烷) :V(乙酸乙酯) = 4 : 1] 监测至反应完成。旋转蒸发脱去溶剂，加入10 mL 甲醇，冰浴下分批加入285 mg NaBH4，室温下继续搅拌30 min，TLC [V(正庚烷) :V(乙酸乙酯) = 3 : 1] 监测至反应完成。旋转蒸发除去甲醇，用乙酸乙酯 (10 mL × 3) 萃取。合并有机相，旋转蒸发除去乙酸乙酯，经硅胶柱层析 [V(正庚烷) :V(乙酸乙酯) = 3 : 1] 提纯，得到目标化合物。

1-(2,6-二氯-4-(三氟甲基) 苯基)-N-(甲氧基甲基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺 (A7)：白色固体845 mg，收率72%，m.p. 138.6～139.5 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6),δ: 9.38(s, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.39 (s, 1H), 8.30 (s, 2H), 5.10 (s, 2H),3.36 (s, 3H)。13C NMR (101 MHz, DMSO-d6),δ: 156.77,156.58, 154.62, 136.50, 135.75, 135.32, 132.41 (q,2JCF= 33.7 Hz),126.21 (q,3JCF= 3.3 Hz), 122.22 (q,1JCF= 272.1 Hz), 100.45,71.61, 55.19。HRMS (EI): C14H10N5OF335Cl2(M+),计算值391.021 5,测试值391.022 2; C14H10N5OF335Cl37Cl (M+), 计算值393.018 5,测试值393.019 2; C14H10N5OF337Cl2(M+), 计算值395.015 6,测试值395.016 3。

1-(2,6-二氯-4-(三氟甲基) 苯基)-N-(乙氧基甲基)-1H-吡唑并[3,4-d] 嘧啶-4-胺 (A8)：白色固体753 mg，收率62%，m.p. 124.4～126.1 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6),δ: 9.31 (t,J= 6.0 Hz, 1H), 8.56 (s, 1H), 8.33 (s, 1H), 8.29 (s,2H), 5.05 (d,J= 6.0 Hz, 2H), 3.59 (q,J= 6.9 Hz, 2H), 1.14 (t,J= 7.0 Hz, 3H)。13C NMR (101 MHz, DMSO-d6),δ: 156.85,156.67, 154.57, 136.47, 135.71, 135.15, 132.43 (q,2JCF= 33.6 Hz),126.44 (q,3JCF= 3.6 Hz), 122.26 (q,1JCF= 272.0 Hz), 100.34,70.00, 62.91, 15.03。HRMS (EI): C15H12N5OF335Cl2(M+), 计算值405.037 1, 测试值405.036 5; C15H12N5OF335Cl37Cl (M+),计算值407.034 2, 测试值407.034 8; C15H12N5OF337Cl2(M+),计算值409.031 2, 测试值409.033 1。

1.2.6 目标化合物B1 的合成 参照文献[26]的方法合成。

化合物B1：白色固体282 mg，收率78%，m.p.234.0～234.6 ℃。1H NMR (400 MHz, CDCl3),δ: 8.38 (s, 1H),8.00 (s, 1H), 7.79 (s, 2H), 3.63 (s, 3H)。13C NMR (101 MHz,CDCl3),δ: 157.19, 153.40, 150.42, 137.88, 136.42, 136.08,133.94 (q,2JCF= 34.2 Hz), 125.95 (q,3JCF= 3.7 Hz), 122.14(q,1JCF= 272.2 Hz), 106.28, 34.01。HRMS (EI):C13H7N4OF335Cl2(M+), 计算值361.994 9, 测试值361.994 8;C13H7N4OF335Cl37Cl (M+), 计算值363.992 0, 测试值363.991 9;C13H7N4OF337Cl2(M+), 计算值365.989 0, 测试值365.989 2。

1.2.7 目标化合物B2～B6 的合成 室温下将1 mmol中间体11 置于25 mL 圆底瓶中，加入5 mL 丙酮、3 mmol 碳酸钾和1.2 mmol 溴代烃或碘代烃，升温至回流，TLC [V(正庚烷) :V(乙酸乙酯) = 3 :1] 监测至反应完成。旋转蒸发脱去溶剂，用乙酸乙酯萃取 (20 mL × 3)。合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发除去乙酸乙酯，经硅胶柱层析 [V(正庚烷) :V(乙酸乙酯) = 3 : 1] 分离提纯，得到目标化合物。

1-(2,6-二氯-4-(三氟甲基) 苯基)-5-乙基-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d] 嘧啶-4-酮 (B2)：白色固体271 mg，收率72%，m.p. 231.4～232.2 ℃。1H NMR (400 MHz, CDCl3),δ:8.39 (s, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.80 (s, 2H), 4.12 (q,J= 7.2 Hz,2H), 1.47 (t,J= 7.2 Hz, 3H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3),δ:156.60, 153.27, 150.04, 137.89, 136.36, 136.09, 133.76 (q,2JCF=34.2 Hz), 125.89 (q,3JCF= 3.6 Hz), 122.12 (q,1JCF= 272.0 Hz), 106.42, 42.04, 15.18。HRMS (EI): C14H9N4OF335Cl2(M+), 计算值376.010 6, 测试值376.010 2; C14H9N4OF335Cl37Cl(M+),计算值378.007 6, 测试值378.007 4; C14H9N4OF337Cl2(M+), 计算值380.004 7, 测试值380.004 5。

1-(2,6-二氯-4-(三氟甲基) 苯基)-5-丙基-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d] 嘧啶-4-酮 (B3)：白色固体293 mg，收率75%，m.p.180.3～180.7 ℃。1H NMR (400 MHz, CDCl3),δ:8.40 (s, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.81 (s, 2H), 4.02 (t,J= 7.3 Hz,2H), 1.91 - 1.81 (m, 2H), 1.04 (t,J= 7.4 Hz, 3H)。13C NMR(101 MHz, CDCl3),δ: 156.77, 153.23, 150.27, 138.01, 137.60,136.41, 133.85 (q,2JCF= 34.1 Hz), 125.93 (q,3JCF= 3.6 Hz),122.14 (q,1JCF= 272.0 Hz), 106.45, 48.41, 23.00, 11.07。HRMS (EI): C15H11N4OF335Cl2(M+), 计算值390.026 2, 测试值390.025 8; C15H11N4OF335Cl37Cl (M+), 计算值392.023 3, 测试值392.023 7; C15H11N4OF337Cl2(M+), 计算值394.020 3, 测试值394.020 3。

1-(2,6-二氯-4-(三氟甲基) 苯基)-5-异丙基-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮 (B4)：白色固体265 mg，收率68%，m.p. 183.7～184.8 ℃。1H NMR (400 MHz, CDCl3),δ:8.30 (s, 1H), 7.96 (s, 1H), 7.72 (s, 2H), 5.20-5.13 (m, 1H), 1.43 (d,J= 6.9 Hz, 6H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3),δ: 156.55,152.74, 147.50, 138.10, 136.41, 136.13, 133.80 (q,2JCF= 34.2 Hz), 125.90 (q,3JCF= 3.7 Hz), 122.14 (q,1JCF= 272.0 Hz),106.19, 45.98, 22.41。HRMS (EI): C15H11N4OF335Cl2(M+),计算值390.026 2, 测试值390.025 9; C15H11N4OF335Cl37Cl(M+), 计算值392.023 3, 测试值392.023 0; C15H11N4OF337Cl2(M+), 计算值394.020 3, 测试值394.020 6。

2-(1-(2,6-二氯-4-(三氟甲基) 苯基)-4-氧代-1,4-二氢-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-5-基) 乙腈 (B5)：白色固体240 mg，收率62%，m.p. 207.6～208.2 ℃。1H NMR (400 MHz, CDCl3),δ: 8.34 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.73 (s, 2H), 4.88 (s, 2H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3),δ: 155.45, 152.74, 148.47, 138.17,136.30, 135.67, 134.52 (q,2JCF= 34.3 Hz), 126.00 (q,3JCF=3.7 Hz), 122.08 (q,1JCF= 272.1 Hz), 113.49, 105.78, 33.30。HRMS (EI): C14H6N5OF335Cl2(M+), 计算值386.990 2, 测试值386.990 1; C14H6N5OF335Cl37Cl (M+), 计算值388.987 2, 测试值388.987 8; C14H6N5OF337Cl2(M+), 计算值390.984 2, 测试值390.984 7。

5-苄基-1-(2,6-二氯-4-(三氟甲基) 苯基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d] 嘧啶-4-酮 (B6)：白色固体263 mg，收率60%，m.p. 160.2～162.0 ℃。1H NMR (400 MHz, CDCl3),δ:8.38 (s, 1H), 8.08 (s, 1H), 7.75 (s, 2H), 7.43 - 7.35 (m, 5H),5.24 (s, 2H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3),δ: 156.80, 150.18,138.16, 137.74, 136.39, 135.33, 133.90 (q,2JCF= 34.3 Hz)129.18, 128.62, 128.29, 128.17, 125.93 (q,3JCF= 3.6 Hz),122.14 (q,1JCF= 272.0 Hz), 106.42, 49.41。HRMS (EI):C19H11N4OF335Cl2(M+), 计算值438.026 2, 测试值438.025 7;C19H11N4OF335Cl37Cl (M+), 计算值440.023 3, 测试值440.023 4;C19H11N4OF337Cl2(M+), 计算值442.020 3, 测试值442.020 8。

1.2.8 目标化合物B7 的合成 室温下将8.5 g 中间体10 置于250 mL 圆底瓶中，加入80 mL 乙醇和2.5 g 80%水合肼，升温至回流，TLC [V(二氯甲烷) :V(甲醇) = 10 : 1] 监测至反应完成。旋转蒸发脱去溶剂，用乙酸乙酯萃取 (50 mL × 3)。合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发除去乙酸乙酯，经硅胶柱层析 [V(二氯甲烷) :V(甲醇) = 10 :1] 分离提纯，得白色固体3 g，收率42%。

5-氨基-1-(2,6-二氯-4-(三氟甲基)苯基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(B7)：m.p. 235.8～236.8 ℃。1H NMR(400 MHz, CDCl3),δ: 8.39 (s, 1H), 8.29 (s, 1H), 7.79 (s, 2H),4.86 (s, 2H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3),δ: 157.11, 152.94,151.11, 137.83, 136.39, 135.93, 134.00 (q,2JCF= 34.2 Hz),125.97 (q,3JCF= 3.7 Hz), 122.12 (q,1JCF= 272.0 Hz),105.90。HRMS (EI): C12H6N5OF335Cl2(M+), 计算值362.990 2, 测试值362.990 0; C12H6N5OF335Cl37Cl (M+), 计算值364.987 2, 测试值364.987 4; C12H6N5OF337Cl2(M+), 计算值366.984 2, 测试值366.984 4。

1.2.9 目标化合物B8～B11 的合成 将0.5 mmol化合物B7 置于干燥的25 mL 两口瓶中，在氩气保护下加入5 mL 无水DCE 和1.5 mmol 三乙胺。将0.65 mmol 酰氯溶于1 mL 无水DCE 中并滴加到上述反应液中，之后升温至回流，TLC [V(二氯甲烷) :V(甲醇) = 10 : 1] 监测至反应完全。旋转蒸发脱去溶剂，用乙酸乙酯萃取 (15 mL × 3)。合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发除去乙酸乙酯，经硅胶柱层析 [V(二氯甲烷) :V(甲醇) = 10 :1] 分离提纯，得到目标化合物B8～B11。

N-(1-(2,6-二氯-4-(三氟甲基) 苯基)-4-氧代-1,4-二氢-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-5-基) 乙酰胺 (B8)：白色固体166 mg，收率82%，m.p. 275.3～275.8 ℃。1H NMR (400 MHz,CDCl3),δ: 8.64 (s, 1H), 8.39 (s, 1H), 7.99 (s, 1H), 7.80 (s, 2H),2.30 (s, 3H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3),δ: 168.12, 157.41,152.75, 151.23, 137.69, 136.52, 135.87, 134.11 (q,2JCF= 34.1 Hz),125.97 (q,3JCF= 3.7 Hz), 122.15 (q,1JCF= 272.1 Hz), 106.10,20.40。HRMS (EI): C14H8N5O2F335Cl2(M+), 计算值405.000 7,测试值405.000 2; C14H8N5O2F335Cl37Cl (M+), 计算值406.997 8,测试值406.998 2; C14H8N5O2F337Cl2(M+), 计算值408.994 8,测试值408.994 4。

N-(1-(2,6-二氯-4-(三氟甲基) 苯基)-4-氧代-1,4-二氢-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-5-基)-2,2,2-三氟乙酰胺 (B9)：白色固体181 mg，收率79%，m.p. 250.7～252.0 ℃。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6),δ: 13.28 (s, 1H), 8.70 (s, 1H), 8.67 (s,1H), 8.35 (s, 2H)。13C NMR (101 MHz, DMSO-d6),δ:156.29(q,2JCF= 38.0 Hz), 153.07, 152.45, 151.95, 138.53,135.44, 135.36, 133.01 (q,2JCF= 33.8 Hz), 126.57 (q,3JCF=3.5 Hz), 122.15 (q,1JCF= 272.2 Hz), 115.37 (q,1JCF= 286.0 Hz), 105.55。HRMS (EI): C14H5N5O2F635Cl2(M+), 计算值458.972 4, 测试值458.972 1; C14H5N5O2F635Cl37Cl (M+), 计算值460.969 5, 测试值460.969 2; C14H5N5O2F637Cl2(M+), 计算值462.966 5, 测试值462.966 5。

N-(1-(2,6-二氯-4-(三氟甲基) 苯基)-4-氧代-1,4-二氢-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-5-基) 异丁酰胺 (B10)：白色粉末163 mg，收率75%，m.p. 260.2～262.0 ℃。1H NMR (400 MHz, CDCl3),δ: 8.54 (s, 1H), 8.37 (s, 1H), 7.97 (s, 1H), 7.79(s, 2H), 2.78-2.68 (m, 1H), 1.32 (d,J= 6.9 Hz, 6H)。13C NMR(101 MHz, CDCl3),δ: 178.07, 154.95, 152.45, 151.06, 138.16,136.37, 135.80, 134.07 (q,2JCF= 34.3 Hz), 125.97 (q,3JCF=3.7 Hz), 122.11 (q,1JCF= 272.2 Hz), 106.30, 33.87, 19.20。HRMS (EI): C16H12N5O2F335Cl2(M+), 计算值433.032 0,测试值433.032 2; C16H12N5O2F335Cl37Cl (M+), 计算值435.029 1,测试值435.029 3; C16H12N5O2F337Cl2(M+), 计算值437.026 1,测试值437.026 6。

N-(1-(2,6-二氯-4-(三氟甲基) 苯基)-4-氧代-1,4-二氢-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-5-基) 丙酰胺 (B11)：白色固体170 mg，收率81%，m.p. 242.6～243.1 ℃。1H NMR (400 MHz,CDCl3),δ: 8.52 (s, 1H), 8.38 (s, 1H), 7.99 (s, 1H), 7.79 (s, 2H),2.55 (q,J= 7.5 Hz, 2H), 1.28 (t,J= 7.5 Hz, 3H)。13C NMR(101 MHz, CDCl3),δ: 175.43, 158.31, 153.45, 151.43, 137.41,136.47, 135.75, 134.05(q,2JCF= 34.2 Hz), 125.97(q,3JCF= 3.7 Hz), 122.12(q,1JCF= 272.0 Hz), 106.40, 31.40, 11.30。HRMS(EI): C15H10N5O2F335Cl2(M+), 计算值419.016 4, 测试值419.016 3;C15H10N5O2F335Cl37Cl (M+), 计算值421.013 4, 测试值421.013 2;C15H10N5O2F337Cl2(M+), 计算值423.010 5, 测试值423.010 0。

1.2.10 目标化合物B12～B13 的合成 将0.5 mmol化合物B7 置于干燥的25 mL 两口瓶中，氩气保护下加入5 mL 无水DCE 和3 mL 三乙胺。将2 mL酰氯溶于1 mL 无水DCE 中，冰浴下滴加到上述反应液中，之后升温至回流，TLC [V(正庚烷) :V(乙酸乙酯) = 3 : 1] 监测至反应结束。旋转蒸发脱去溶剂，用乙酸乙酯萃取 (15 mL × 3)。合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发除去乙酸乙酯，经硅胶柱层析 [V(正庚烷) :V(乙酸乙酯) = 3 :1] 分离提纯，得到目标化合物B12～B13。

N-(1-(2,6-二氯-4-(三氟甲基) 苯基)-4-氧代-1,4-二氢-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-5-基)-N-丙酰基丙酰胺 (B12)：白色固体178 mg，收率75%，m.p. 168.4～169.6 ℃。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6),δ: 8.71 (s, 1H), 8.58 (s, 1H), 8.36 (s,2H), 2.70 (q,J= 7.2 Hz, 4H), 1.04 (t,J= 7.2 Hz, 6H)。13C NMR (101 MHz, DMSO-d6),δ: 173.49, 153.91, 153.31,152.14, 138.76, 135.43, 135.34, 133.00 (q,2JCF= 33.8 Hz),126.59 (q,3JCF= 3.6 Hz), 122.15 (q,1JCF= 272.2 Hz), 105.74,29.58, 8.24。HRMS (EI): C18H14N5O3F335Cl2(M+), 计算值475.042 6, 测试值475.042 8; C18H14N5O3F335Cl37Cl (M+), 计算值477.039 6, 测试值477.038 5; C18H14N5O3F337Cl2(M+),计算值479.036 7, 测试值479.035 7。

N-丁酰基-N-(1-(2,6-二氯-4-(三氟甲基) 苯基)-4-氧代-1,4-二氢-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-5-基) 丁酰胺 (B13)：白色固体179 mg，收率71%，m.p. 150.4～151.2 ℃。1H NMR(400 MHz, CDCl3),δ: 8.42 (s, 1H), 7.81 (s, 2H), 7.77 (s, 1H),2.70 (t,J= 7.2 Hz, 4H), 1.77-1.68 (m, 4H), 0.98 (t,J= 7.4 Hz,6H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3),δ: 172.88, 154.16, 152.25,151.03, 138.65, 136.28, 135.67, 134.16 (q,2JCF= 34.3 Hz), 126.00(q,3JCF= 3.6 Hz), 122.09 (q,1JCF= 272.1 Hz), 106.56, 38.42,17.54, 13.42。HRMS (EI): C20H18N5O3F335Cl2(M+), 计算值503.073 9, 测试值503.074 3; C20H18N5O3F335Cl37Cl (M+), 计算值505.070 9, 测试值505.071 4; C20H18N5O3F337Cl2(M+),计算值507.068 0, 测试值507.067 8。

1.2.11 目标化合物B14 的合成 合成方法同化合物B8～B11。

N-(1-(2,6-二氯-4-(三氟甲基)苯基)-4-氧代-1,4-二氢-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-5-基)甲磺酰胺(B14)：白色固体183 mg，收率83%，m.p. 238.5～239.6 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6),δ: 11.44 (s, 1H), 8.66 (s, 1H), 8.49 (s, 1H),8.34 (s, 2H), 3.24 (s, 3H)。13C NMR (101 MHz, DMSO-d6),δ:154.47, 153.86, 152.02, 138.50, 135.52, 135.38, 132.97 (q,2JCF=33.8 Hz), 126.51 (q,3JCF= 3.5 Hz), 122.14 (q,1JCF= 272.2 Hz), 105.63, 42.09。HRMS (EI): C13H8N5O3F3S35Cl2(M+),计算值440.967 7, 测试值440.967 4; C13H8N5O3F3S35Cl37Cl(M+), 计算值442.964 8, 测试值442.964 1; C13H8N5O3F3S37Cl2(M+), 计算值444.961 8, 测试值444.961 4。

1.2.12 目标化合物B15 的合成 将364 mg 化合物B7 置于25 mL 圆底瓶中，加入10 mL 乙醇和106 mg 苯甲醛，升温至回流。待反应完全，旋转蒸发脱去溶剂，加入10 mL 甲醇，冰浴搅拌下分多批加入95 mg NaBH4，加完后室温搅拌。TLC [V(正庚烷) :V(乙酸乙酯) = 3 : 1] 监测至反应完成。旋转蒸发脱去溶剂，用乙酸乙酯萃取 (15 mL ×3)。合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发脱去溶剂，经硅胶柱层析 [V(正庚烷) :V(乙酸乙酯) =3 : 1] 分离提纯，得白色固体199 mg，收率44%。

5-(苄基氨基)-1-(2,6-二氯-4-(三氟甲基)苯基)-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(B15)： m.p. 216.8～217.2 ℃。1H NMR (400 MHz, CDCl3),δ: 9.23 (s, 1H), 8.04 (s, 1H), 7.73(s, 2H), 7.71-7.66 (m, 2H), 7.42-7.36 (m, 3H), 5.10 (d,J= 6.0 Hz, 2H), 4.87 (t,J= 6.0 Hz, 1H)。13C NMR (101 MHz,CDCl3),δ: 159.65, 153.35, 149.51, 140.64, 136.15, 135.76,134.78, 133.88 (q,2JCF= 34.3 Hz), 130.39, 128.67, 127.37,126.02 (q,3JCF= 3.7 Hz), 122.03 (q,1JCF= 272.1 Hz), 103.86,65.07。HRMS (ESI): C19H11N5OF335Cl2(M-H)-, 计算值452.029 3,测试值452.029 5; C19H11N5OF335Cl37Cl (M-H)-, 计算值454.026 3,测试值 454.026 6; C19H11N5OF337Cl2(M-H)-, 计算值456.023 4,测试值456.024 2。

1.2.13 目标化合物B16 的合成 将2 070 mg 盐酸羟胺置于50 mL 圆底瓶中，加入25 mL 乙醇，室温搅拌下加入三乙胺调节pH 值至7～8，加入1 269 mg 中间体10，升温至回流。TLC [V(二氯甲烷) :V(甲醇) = 10 : 1] 监测至反应结束。旋转蒸发脱去溶剂，用乙酸乙酯萃取 (30 mL × 3)。合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发脱去溶剂，经硅胶柱层析 [V(二氯甲烷) :V(甲醇) = 10 : 1] 分离提纯，得白色固体381 mg，收率35%。

1-(2,6-二氯-4-(三氟甲基) 苯基)-5-羟基-1,5-二氢-4H-吡唑并[3,4-d] 嘧啶-4-酮 (B16)：m.p. 218.2～218.8 ℃。1H NMR (400 MHz, CDCl3),δ: 10.73 (s, 1H), 8.42 (s, 1H),8.42 (s, 1H), 7.82 (s, 2H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3),δ:154.74, 151.97, 144.95, 137.46, 136.37, 135.68, 134.16 (q,2JCF= 34.3 Hz), 126.02 (q,3JCF= 3.6 Hz), 122.09 (q,1JCF=272.0 Hz), 105.98。HRMS (EI): C12H5N4O2F335Cl2(M+), 计算值363.974 2, 测试值363.975 0; C12H5N4O2F335Cl37Cl (M+),计算值365.971 2, 测试值365.971 2; C12H5N4O2F337Cl2(M+),计算值367.968 3, 测试值367.968 6。

1.2.14 目标化合物B17 的合成 将182 mg 化合物B16 置于干燥的25 mL 两口瓶中，在氩气保护下加入5 mL 乙酸酐，升温至120 ℃。TLC [V(正庚烷) :V(乙酸乙酯) = 3 : 1] 监测至反应完成。冷却至室温，将反应液倒入30 mL 冰水中，用乙酸乙酯萃取 (30 mL × 3)。合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发脱去溶剂，经硅胶柱层析 [V(正庚烷) :V(乙酸乙酯) = 3 : 1] 分离提纯，得白色固体168 mg，收率83%。

1-(2,6-二氯-4-(三氟甲基)苯基)-4-氧代-1,4-二氢-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-5-基乙酸酯(B17)：m.p. 186.6～187.4 ℃。1H NMR (400 MHz, CDCl3),δ: 8.41 (s, 1H), 7.97 (s, 1H), 7.80(s, 2H), 2.47 (s, 3H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3),δ: 166.61,154.48, 151.58, 146.86, 138.32, 136.34, 135.72, 134.05 (q,2JCF=34.3 Hz), 125.96 (q,3JCF= 3.6 Hz), 122.10 (q,1JCF= 272.1 Hz), 107.40, 17.77。HRMS (EI): C14H7N4O3F335Cl2(M+), 计算值405.984 7, 测试值405.985 2; C14H7N4O3F335Cl37Cl (M+),计算值407.981 8, 测试值407.982 1; C14H7N4O3F337Cl2(M+), 计算值409.978 8, 测试值409.978 9。

为进一步确证化合物B2～B6 的结构，对化合物B2 进行了X 射线衍射研究。将30 mg 化合物B2 置于核磁管中，加入0.6 mL 氘代氯仿溶解，盖上核磁帽，室温静置7 d 后析出无色透明晶体。单晶衍射结果表明，化合物B2 为酮式结构 (图2)。

1.3 生物活性测试

试验靶标：小菜蛾Plutella xylostella、黏虫Mythimna separate、苜蓿蚜Aphis craccivora的3 龄幼虫以及朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus成螨。

采用《农药室内生物测定试验准则》规定的浸虫法和浸叶法[28]进行杀虫活性测试。对黏虫和小菜蛾的活性测试在光照培养箱中进行，温度25 ℃，光照14 h(L) : 10 h(D)，相对湿度 ≥ 50%；对朱砂叶螨和苜蓿蚜的测试在观察室中进行，温度15～25 ℃，光照14 h(L) : 10 h(D)，相对湿度50%～80%。目标化合物的测试质量浓度为500 mg/L(40 mL，其中吐温-80 的体积分数为0.05%，DMF的体积分数为5%)，对照药剂氟虫腈的测试浓度为20 mg/L。不同靶标的测试方法如下。

小菜蛾：将油菜苗 (2 片叶) 浸入药液中10 s，晾干后放入培养皿 (8 株/皿)，接入小菜蛾3 龄幼虫 (10 头/皿) 并盖严培养皿。3 组重复。置于光照培养箱内，于药后72 h 统计死亡虫数。

黏虫：将9 株新鲜玉米苗剪成叶段，浸入药液中10 s，晾干后放入培养皿内 (3 株/皿)，接入黏虫3 龄幼虫 (10 头/皿) 并盖严培养皿。3 组重复。置于光照培养箱内，于药后72 h 统计死亡虫数。

朱砂叶螨：采用浸螨法。将带柄的蚕豆单叶插入加满水的青霉素瓶中，接雌成螨 (≥15 头/叶)。将带螨单叶浸药10 s 并用吸水纸吸走多余液体，用带孔的塑料杯罩住。3 组重复。置于观察室内，于药后72 h 统计死亡虫数。

苜蓿蚜：将带柄的蚕豆单叶插入加满水的青霉素瓶中，每叶接成蚜5 头，用带孔的塑料杯罩住。于接虫16 h 时去除成蚜。选取 ≥15 头若蚜的单叶，浸药10 s，晾干，用带孔的塑料杯罩住。3 组重复。置于观察室内，于72 h 后统计死亡虫数。

1.4 理化性质预测及分子对接

用B3LYP/6-311G(d,p) 方法对氟虫腈进行构象优化，用网络服务器ALOGPS 2.1 (http://www.vcclab.org/lab/alogps/start.html) 对目标化合物的logP和logS进行预测，用软件ACD/Labs 预测化合物的pKa，用MOE 预测化合物的极性表面积(TPSA)。基于本课题组前期构建的褐飞虱GABA受体模型[29]，采用Glide 方法进行分子对接，活性口袋设置为以 -2′Pro 到9′Leu 氨基酸残基为中心周围20 Å 的区域。

2 结果与分析

2.1 目标化合物合成

以1,2,3-三氯-5-(三氟甲基) 苯为原料，在高温高压下合成对应的苯肼，然后分别通过环加成合成中间体4、7、10，再经过1～2 步合环生成相应的嘧啶胺、嘧啶酮结构，并进行取代衍生，所有终产物的合成均控制在6 步之内。

在合成化合物B16 时，因中间体10 对酸不稳定，在pH 值等于5 的盐酸羟胺乙醇溶液中室温搅拌2～3 min，席夫碱即可断裂而形成中间体9，所以调节pH 值到7～8 是关键步骤。

2.2 杀虫活性

测试结果 (表1) 表明：在500 mg/L 下，部分目标化合物对小菜蛾表现出中等活性，其中化合物A3～A5 的活性随氨基取代基链长的增加而提高；在嘧啶酮骨架的化合物中，化合物B1、B4及B5 对小菜蛾的致死率分别为43%、73%和40%。

表1 目标化合物的理化性质以及杀虫活性 (500 mg/L)Table 1 The physicochemical properties and insecticidal activities of the target compounds (500 mg/L)

续表1Table 1 (Continued)

2.3 理化性质及结合模式研究

化合物理化性质预测结果 (表1) 表明，化合物logP值在2.69～4.25 之间，处于合理的范围，但目标化合物logS比氟虫腈小，溶解度较差；而pKa以及TPSA 均与氟虫腈差异较大，尤其化合物B8、B10、B11 和B16，pKa值接近7，在中性溶液中容易解离，亲水性较强、亲脂性较差，导致难以通过细胞膜到达靶标，这些都可能是导致其活性降低的原因。

如图3 所示，化合物B4 与氟虫腈都能结合在GABA 受体TM2 区域-2′Pro 到9′Leu 氨基酸残基所围成的口袋中。比较它们的结合模式发现，B4 的氧原子可以和6′Thr 形成氢键，距离为2.0 Å，氟虫腈的氰基、氨基分别和6′Thr 形成距离为2.1 Å和2.4 Å的氢键相互作用。氨基的缺失可能是化合物B4 比氟虫腈活性低的关键因素。另外，B4 在结合口袋中的构象较为倾斜，与氟虫腈在结合口袋中的构象存在差异，这也可能是导致其活性降低的原因之一。

3 结论

本研究基于氟虫腈低能构象，用芳香环模拟氟虫腈分子内氢键，合成了25 个未见报道的苯基吡唑并嘧啶胺和苯基吡唑并嘧啶酮类化合物，并初步测定了其对小菜蛾、黏虫、苜蓿蚜以及朱砂叶螨的杀虫活性。结果表明，化合物B4 等4 个化合物对小菜蛾表现出中等的杀虫活性，但活性仍低于氟虫腈。化合物活性较差的原因可能是理化性质及结合模式和氟虫腈存在差异。