一测多评法同时测定不同厂家蛇床子配方颗粒中7种香豆素类成分含量的研究*

河北中医学院 河北省高校中药配方颗粒应用技术研发中心 河北省中药配方颗粒技术创新中心

张 闯 李葆林 陈世雨 高 乐 田 伟 牛丽颖(石家庄 050091)

提要 目的：研究以不同厂家蛇床子配方颗粒为研究对象，采用“一测多评”(QAMS)法，为蛇床子配方颗粒质量标准的制定提供依据。方法：以蛇床子素为内参物，分别建立蛇床子配方颗粒中伞形花内酯、花椒毒酚、花椒毒素、异茴芹素、佛手柑内酯和欧前胡素的相对校正因子，并利用相对校正因子计算6种成分的含量。同时，采用QAMS和外标法(ESM)对不同厂家共16批蛇床子配方颗粒中上述7种香豆素类成分进行含量测定，验证一测多评法的准确性、可行性和适用性。结果：本研究建立的QAMS法同时检测不同厂家16批蛇床子配方颗粒中7种香豆素成分的含量与ESM法之间无显著性差异，且相对校正因子重现性良好。结论：本研究建立的一测多评法可用于蛇床子配方颗粒的质量控制。

蛇床子FructusCnidii为伞形科植物蛇床Cnidiummonnieri(L.) Cuss的干燥成熟果实，味苦性温、归肾经，具有温肾壮阳、杀虫止痒、燥湿祛风的功效[1-2]。蛇床子所含主要化学成分为蛇床子素等香豆素类化合物[3-4]。中药配方颗粒因其即冲即服、易于携带等特点，临床上应用越来越普遍，其质量控制逐渐成为中药研究热点之一[5-6]。本研究基于一测多评(QAMS)法，以价格较低、稳定易得的蛇床子素为内参物，建立蛇床子素与伞形花内酯、花椒毒酚、花椒毒素、异茴芹素、佛手柑内酯和欧前胡素的相对校正因子(f)，从而利用一种对照品(蛇床子素)计算出蛇床子配方颗粒中7种香豆素类成分含量[7-9]，并将此结果与外标法测得结果进行比较，验证QAMS法在蛇床子配方颗粒质量评价中的准确度及可行性，以期为蛇床子配方颗粒的多成分质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters e2695高效液相色谱仪(美国沃特世科技有限公司)、Ultimate3000双三元液相色谱仪(美国赛默飞世尔科技有限公司)、SPD-M20A高效液相色谱仪(日本岛津公司)、电子天平(ME204E/02型，瑞士梅特勒-托利多公司)、Milli-Q超纯水机(美国密理博公司)、KQ-250E型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药 实验所用各对照品：伞形花内酯(批号：J0222AS)与佛手柑内酯(批号：J1026AS)购自大连美仑生物技术有限公司，花椒毒酚(批号：16090904)、花椒毒素(批号：151019)、异茴芹素(批号：16081803)、欧前胡素(批号：160511)购自成都普菲德生物技术有限公司，蛇床子素(批号：110822-201308)购于中国食品药品检定研究院，各对照品质量分数均≥98%，可供含量测定用色谱级甲醇(Fisher公司)，超纯水为实验室自制。蛇床子配方颗粒样品购自省级医院，蛇床子配方颗粒样品信息见表1。

表1不同厂家蛇床子配方颗粒样品信息表

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 混合对照品溶液的制备：精密称取伞形花内酯、花椒毒酚、花椒毒素、异茴芹素、佛手柑内酯、欧前胡素和蛇床子素对照品适量，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度线，超声溶解，配制成质量浓度分别为233.94 mg/L,115.75 mg/L,90.11 mg/L,152.47 mg/L,70.88 mg/L,547.39 mg/L,171.36 mg/L的单一对照品溶液。分别精密量取等体积上述对照品溶液，置同一量瓶中，配置成含伞形花内酯33.42 mg/L，花椒毒酚16.54 mg/L，花椒毒素12.87 mg/L，异茴芹素21.78 mg/L，佛手柑内酯 10.13 mg/L，欧前胡素78.20 mg/L，蛇床子素24.48 mg/L的混合对照品溶液，4 ℃冷藏备用。

2.1.2 供试品溶液的制备：精密称取蛇床子配方颗粒(S1)0.1 g，倒入100 mL具塞锥形瓶中，加入甲醇100 mL，称重，超声提取30 min，放冷，用甲醇补足减失的质量，摇匀。滤纸过滤，滤液过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.2 色谱条件 Waters XBridge C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇(A) - 0.1%磷酸(B)，梯度洗脱(0～10 min,5%～30%A；10～23 min,30%～40%A；23～35 min,40%～40%A；35～40 min,40%～50%A；25～38 min,90%～100%A； 38～45 min,100%A)；柱温40 ℃；体积流量1.0 mL/min；检测波长320 nm，进样体积10 μL，混合对照品和供试品溶液HPLC图，见图1。

注：1.伞形花内酯;2.花椒毒酚;3.花椒毒素;4.异茴芹素;5.佛手柑内酯;6.欧前胡素;7.蛇床子素。

2.3 方法学验证

2.3.1 线性范围考察：将“2.1.1”项下制备的混合对照品溶液分别稀释至标准品溶液浓度的1、2、4、8、16倍，按照“2.2”项下色谱条件依次进样，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制各对照品的回归方程，结果见表2。

表2蛇床子配方颗粒中7种香豆素类成分的线性关系考察结果 (μg/mL)

2.3.2 精密度试验：精密吸取混合对照品溶液，按照“2.2”项下色谱条件连续进样6次，计算得到伞形花内酯、花椒毒酚、花椒毒素、异茴芹素、佛手柑内酯、欧前胡素和蛇床子素色谱峰的峰面积RSD分别为1.94%、2.17%、1.97%、2.16%、2.20%、2.51%、2.50%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 稳定性试验：精密吸取同一蛇床子配方颗粒供试品溶液(S1)，分别溶液配好后0、2、4、6、8、12、24、48 h，按照“2.2”项下色谱条件进样测定。结果1～7号峰的峰面积RSD分别为0.62%、1.20%、1.29%、1.57%、0.66%、0.78%、0.84%，表明蛇床子配方颗粒供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.3.4 重复性试验：取同一批蛇床子配方颗粒6份，按方法与结果 “2.1.2”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，计算蛇床子配方颗粒中伞形花内酯、花椒毒酚、花椒毒素、异茴芹素、佛手柑内酯、欧前胡素和蛇床子素色谱峰的平均质量分数，计算其RSD分别为0.33%、1.59%、0.93%、1.04%、0.59%、0.77%、0.67%，表明本方法重复性良好。

2.3.5 加样回收率试验：取重复性试验同批蛇床子配方颗粒(S1)6份，每份约0.05 g，精密称定，分别加入与蛇床子配方颗粒中7种香豆素类成分近似相等含量的对照品溶液，按照 “2.1.2”项下方法制备供试品溶液，“2.2”项下色谱条件进样检测，计算加样回收率。结果显示，1～7号峰的加样回收率分别为100.62%、101.19%、100.69%、100.41%、100.09%、100.27%、100.22%，RSD分别为1.31%、0.49%、1.02%、1.14%、1.10%、1.04%、0.50%，表明本方法准确度良好。

2.4 相对校正因子(fs/i)的建立 本实验采用多点矫正法。根据公式fs/i=fs/fi=As×Ci/(Ai×Cs)计算QAMS的相对校正因子(fs/i)，式中fs/i为内标物s对待测组分i的校正因子，As为内标物s峰面积，Cs为内标物s浓度，Ai为组分i峰面积，Ci为组分i浓度。以蛇床子素为内参物(s)，根据公式分别计算蛇床子素对伞形花内酯(A)、花椒毒酚(B)、花椒毒素(C)、异茴芹素(D)、佛手柑内酯(E)和欧前胡素(F)的相对校正因子，结果见表3。同时，本研究还对不同高效液相色谱仪、不同色谱柱、不同进样体积、不同色谱柱柱温、不同流动相体积流量、不同检测波长对fs/i的影响，结果表明这些因素对fs/i无影响。

表3 各组分的相对校正因子测定结果

2.5 待测成分的色谱峰定位 本部分通过计算在不同色谱仪和不同色谱柱中，蛇床子配方颗粒中各组分的色谱峰与蛇床子素色谱峰的相对保留时间(ts/i)，对供试品中7种香豆素组分色谱峰进行定位，结果见表4。结果显示，不同仪器与色谱柱测得的ts/i的RSD分别为2.53%、1.81%、1.78%、1.50%、0.57%、0.62%，均小于3%，表明可以以ts/i对蛇床子配方颗粒中各组分的色谱峰定位。

表4不同仪器与色谱柱测得各成分相对保留时间

2.6 QAMS与外标法(ESM)测定结果的比较 取16批不同厂家生产的蛇床子配方颗粒，按照相同饮片量计算给药剂量，制成供试品溶液。分别采用QAMS和外标法计算不同厂家16批蛇床子配方颗粒中1～7号峰的含量，每批3份，结果见表5。比较QAMS法与ESM测得的各组分含量，发现2种方法测得的蛇床子配方颗粒中7种组分含量基本一致，RSD小于3%，可认为建立的QAMS法可以替代ESM用于蛇床子配方颗粒中7种香豆素成分的含量测定。

表5 QAMS法与外标法测定16批蛇床子配方颗粒中7种香豆素类成分含量测定的结果 (mg/g)

3 讨论

本研究考察了3种高效液相色谱仪和2种色谱柱对蛇床子配方颗粒中7种香豆素类成分分离的影 响，同时通过不同进样体积、不通色谱柱柱温、不同流动相流速、不同检测波长，以及相对校正因子和相对保留时间的可靠性进行了考察。结果发现不同仪器、不同色谱柱、不同柱温、不同流速下的相对校正因子和相对保留时间的RSD均小于3.0%，说明该QAMS法的系统耐用性良好。

本实验收集了6个厂家生产的16批蛇床子配方颗粒，根据常规的外标法和建立的一测多评的方法，分别对16批蛇床子配方颗粒进行含量测定和准确度分析，验证了QAMS法的准确性和可行性。结果发现，2种含量测定的结果基本一致，无显著性差异，说明本研究建立的QAMS法可用于蛇床子配方颗粒的质量控制。从16批蛇床子配方颗粒含量测定结果来看，7种香豆素类成分中，花椒毒酚与蛇床子素含量最高，而伞形花内酯和花椒毒素含量较低。

本研究建立的QAMS分析方法，在只有蛇床子素标准品的情况下，能够利用相对校正因子同时测得蛇床子配方颗粒中7种成分的含量，降低了检测成本，提高了检测效率，对蛇床子配方颗粒评价标准的完善具有重要意义，也将有利于QAMS法在中药质量控制中的推广。