三叶青总黄酮对大鼠H9C2细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

郭永梅，张传林，王 芳

(1.江西医学高等专科学校 药学系，江西 上饶 334000，2.江西医学高等专科学校第一附属医院，江西 上饶 334000)

心肌缺氧复氧 (Hypoxia/reoxygenation，H/R)损伤是缺血性心肌病及心脏手术后出现心衰的一种常见损伤，是世界性难题[1]。21世纪以来，越来越多研究表明，黄酮类化合物有很好的心血管保护作用，可以适当减少心肌H/R损伤及一些炎症因子反应[2]。三叶青是我国特有的药用植物，为葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg)，具有清热解毒祛肿等功效[3]。在课题组前期的研究中发现黄酮类化合物存在于三叶青中，其对心血管疾病可能有一定治疗作用。迄今为止，关于三叶青总黄酮对心肌H/R损伤的保护作用少有报道。本研究拟通过建立H/R模型，进而探讨三叶青总黄酮对细胞H/R损伤的保护作用。

1 材料与仪器

1.1 细胞株

大鼠H9C2细胞(采购于中国科学院上海细胞库)。

1.2 药物与试剂

三叶青由上饶市红日农业开发有限公司提供(采自上饶怀玉山)；高糖 DMEM培养基(碧云天生物公司)；胎牛血清(四季青)。

1.3 主要仪器

SW-CJ-1F超净工作台(购于苏州安泰技术有限公司)；二氧化碳细胞培养箱(购于美国赛默飞公司)；荧光定量PCR仪(购于美国Applied Biosystems)；IX71 倒置荧光显微镜(购于日本奥林巴斯)；INSYTE5流式细胞仪(购于美国 MilliporeGAVUA)；Mk3酶标仪(购于美国Wellscan)。

2 方法

2.1 三叶青总黄酮的制备

三叶青总黄酮的提取工艺参考文献方法[3]：三叶青干粉首先用60%的乙醇提取2次，提取时间为80 min和60 min各一次，用D101大孔树脂吸附提取液，洗脱的次序为20% 乙醇洗脱后收集40% 乙醇，洗脱的部分即是三叶青总黄酮，质量分数>80%。

2.2 细胞的培养

细胞用含 10% 胎牛血清的高糖 DMEM 培养液中于37 ℃，5% CO2下培养，当细胞融合度达80～90%时进行传代，每3天传代1次，取对数生长期细胞接种，以便进行后续实验。

2.3 三叶青总黄酮对大鼠H9C2 细胞的增殖抑制实验

将高糖DMEM(含10%胎牛血清)培养大鼠H9C2细胞，制成 5×104/mL的细胞悬液，按100μL/孔接种在 96 孔板，于 37 ℃培养箱(含 5% CO2)中孵育24 h，吸弃原培养液，分别用3、6、9、18、36、72μg·mL-1等浓度的三叶青总黄酮处理24 h。结束前4 h加1.9 mg /mL的MTT液20μL，再培养4 h，用酶标仪于490 nm波长检测光密度D(λ)值。实验须重复3次并取3个重复孔为均值，计算三叶青总黄酮作用24 h 后细胞的成活率，实验重复3次。细胞成活率=[1-D(λ)加药D(λ)对照]×100%

2.4 大鼠H9C2 细胞H/R模型的建立

将含10%胎牛血清的高糖DMEM培养H9C2心肌细胞，制成5×104/mL-1的细胞悬液，后按100μL/孔接种96孔板，并于37 ℃培养箱(含5% CO2)中孵育24h，等细胞融合度达到80%～90%时对细胞进行以下缺氧处理：用DMEM培养液配制氯化钴溶液，浓度在600～1 600μmol·L-1之间，分别于6 h、12 h、18 h、24 h确定氯化钴浓度及缺氧时间。估约最佳复氧时间，缺氧时间完成后，摒弃缺氧液，用高糖DMEM培养液(含10%胎牛血清)分别复氧1 h、2 h、3 h、6 h。

2.5 药物处理

实验为正常组(正常培养)，H/R模型组(总浓度为1 200μmol·L-1的氯化钴经缺氧18 h后弃缺氧液，用高糖 DMEM培养液(含10%胎牛血清)继续培养2 h和三叶青总黄酮低(3μg/mL-1)、中(6μg/mL-1)、高(9μg/mL-1)浓度预处理组(药物预处理细胞24 h，其他步骤同H/R模型组)。

2.6 指标检测

2.6.1 检测生化指标 按各自检测试剂盒中的说明书，提取培养液上清及细胞内蛋白，分别检测SOD活性，MDA含量、LDH释放量。

2.6.2 检测细胞成活率 实验结束时加入1.9 mg/mL-1的 MTT液 20μL，后续过程同“2.3”项。

2.6.3 检测细胞凋亡率 细胞用不含EDTA的胰酶先消化收集，再用PBS洗涤2次(2 000 r/min离心5 min)，并收集2×105个细胞，之后加入500μL Binding Buffer 悬浮细胞，再加入Annexin V-FITC(5μL)混匀后，最后加入Propidium Io-dide(5μL)，混匀，于室温中避光反应10 min，用流式细胞仪检测早期凋亡和晚期凋亡细胞百分率。

2.6.4 检测 HIF-1α蛋白表达 提取细胞的总蛋白，并检测蛋白的含量。先各组取40μg的蛋白，经SDS-PAGE电泳后，转移到PVDF膜上，再用脱脂奶粉(50 g/L-1)封闭2 h，加入兔抗大鼠HIF-1α(一抗)4 ℃过夜，然后用TBST洗3遍，再加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔(二抗)，常温孵育2 h，再用TBST洗3遍。最后用ECL 试剂盒曝光显色，扫描并保存图像。

2.7 统计学处理

3 结果

3.1 不同浓度下三叶青总黄酮对大鼠H9C2细胞增殖的影响

结果如图1所示，当药物的浓度达9μg/mL-1时，大鼠H9C2细胞的成活率显著高于空白对照组，但是随着药物浓度的提高，大鼠细胞的成活率则逐渐降低，故而以三叶青总黄酮9μg/mL-1为最高浓度，依次设定低、中、高浓度分别为3、6、9μg/mL-1。

3.2 大鼠H9C2 细胞H/R模型的建立

结果如图2、图3所示，氯化钴的浓度越高，作用时间越长，细胞成活率则逐渐降低；而当复氧时间高于2 h后，细胞的活力则开始恢复，成活率开始升高。因此可以得出当氯化钴浓度为1 200μmol/L-1，缺氧时间为18 h，复氧时间为2 h是本实验细胞H/R损伤模型的最佳条件。

图1 不同浓度三叶青总叶黄酮对大鼠H9C2细胞增殖的影响

图2 氯化钴浓度及缺氧作用时间对大鼠H9C2 细胞成活率的影响

3.3 三叶青总黄酮对H/R损伤大鼠H9C2 心肌细胞成活率的影响

结果如图4所显示，与模型组相对比，三叶青总黄酮6、9μg/mL-1组细胞成活率显著升高(P<0.05)。

图3 不同复氧时间对大鼠H9C2细胞成活率的影响

注：与正常对照组比较，*P<0.05，与模型组比较，#P<0.05。

3.4 三叶青总黄酮对H/R损伤大鼠H9C2细胞上清液中LDH 及细胞内MDA、SOD水平的影响

结果如表1所显示，比较正常对照组，模型组的上清液中的LDH 及细胞内 MDA 水平明显提高，细胞内SOD活性明显下降(P<0.05)。相比于模型组，三叶青总黄酮中剂量组、高剂量组上清液中LDH活性明显下降，三叶青总黄酮各剂量组细胞内 MDA水平明显下降，SOD活性明显提高(P<0.05)。

3.5 三叶青总黄酮对H/R损伤大鼠H9C2细胞凋亡的影响

结果如图 5 所示，比较正常对照组，模型组的凋亡细胞明显增加，经过三叶青总黄酮预处理后，凋亡的细胞有所减少。

3.6 三叶青总黄酮对H/R损伤大鼠H9C2 心肌细胞HIF-1α 蛋白表达的影响

结果如图6所示，比较正常对照组，模型组的 HIF-1α 蛋白表达明显升高(P<0.01)。比较模型组，三叶青总黄酮中剂量组、高剂量组 HIF-1α 蛋白表达明显下降(P<0.05或P<0.01)。

表1 三叶青总黄酮对H/R损伤H9C2细胞中 LDH 及细胞内 MDA、SOD 水平的影响

注：A.正常对照组 B.模型组 C.三叶青总黄酮 9μg/mL组。

注：与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。

4 讨论

LDH是一种胞内酶，根据漏出的多少可直接反应细胞受损的情况。据本次的研究可以看出，与对照组相比，模型组细胞培养液中LDH含量升高明显，但经过三叶青总黄酮的预处理后，细胞培养液中的 LDH 含量明显下降。缺氧后的心肌细胞，能量代谢紊乱，细胞膜会收到受损。而复氧后，随着大量的氧气涌入，会产生了大量的自由基，并且会发生脂质过氧化等一系列反应。而氧自由基攻击生物膜不饱和脂肪的终产物是MDA，测定其含量就能间接反应细胞的受损情况如何。

SOD是一种抗氧化酶，能清除氧自由基[4]。本次实验结果显示，经三叶青总黄酮处理后，细胞内MDA含量下降，而SOD活性增加，由此可以看出，三叶青总黄酮能降低细胞H/R的损伤。细胞H/R损伤后的一个重要指标是凋亡。本实验流式细胞术检测结果显示三叶青总黄酮能有效抑制细胞凋亡。经相关研究表明心肌缺血的发生机制跟 HIF-1α有关[5]。一般在常氧环境下，HIF-1α被脯氨酸羟基化酶(PHD)羟基化后在细胞内降解。而在缺氧时，可抑制PHD的活性，HIF-1α被活化[6]。从本实验结果中可以看出，三叶青总黄酮可通过调节HIF-1α的表达来保护细胞H/R损伤。综上所述，三叶青总黄酮具有保护细胞H/R损伤作用，它的机制有可能与抗氧化及抗细胞凋亡有一定关联。