高效液相色谱法测定CBZ-伐昔洛韦对映异构体杂质

赵 婕，杜 胜，张 达

(宜昌天仁药业有限责任公司，湖北 宜昌 443000)

盐酸伐昔洛韦是阿昔洛韦的前体药物，口服后吸收迅速并在体内很快转化为阿昔洛韦，其抗病毒作用为阿昔洛韦所发挥，用于治疗I型和II型单纯性抱疹及带状抱疹。目前盐酸伐昔洛韦已经取代阿昔洛韦成为治疗带状疱疹、生殖器疱疹的一线药物[1]。

由于盐酸伐昔洛韦的日用剂量比较大，所以对盐酸伐昔洛韦原料药中杂质含量的要求非常严格。N-苄氧羰基-L-缬氨酸 2-[(2-氨基-1,6-二氢-6-氧代-9H-嘌呤-9-基)甲氧基]乙基酯(CBZ-伐昔洛韦)是盐酸伐昔洛韦的关键中间体，经过氢化反应得到伐昔洛韦，再成盐即得到盐酸伐昔洛韦[2]。CBZ-伐昔洛韦的纯度对最终产品纯度的影响非常大，因此制备高纯度的CBZ伐昔洛韦是制备高纯度盐酸伐昔洛韦的前提条件。

CBZ-伐昔洛韦(Cbz-Valaciclovir)又叫N-苄氧羰基-L-缬氨酸 2-[(2-氨基-1,6-二氢-6-氧代-9H-嘌呤-9-基)甲氧基]乙基酯，是一种由Cbz保护的缬氨酸，广泛应用于药物合成领域。CBZ-伐昔洛韦用于生化试剂，万乃洛韦或伐昔洛韦等洛韦系列侧链合成，增压素等其它多肽合成。目前，《中国药典》2020年版二部中对盐酸伐昔洛韦的光学纯度仅进行比旋度检测来监控[3]，但美国药典和欧洲药典对盐酸伐昔洛韦原料药中异构体杂质D-伐昔洛韦均有明确的限度要求[4-5]。经文献报道，异构体杂质D-伐昔洛韦主要产生于偶合工序碱催化缩合反应的羧基活化的过程中，影响异构体产生的主要因素是羧基活化时的温度和时间[2]。因此，CBZ-伐昔洛韦作为盐酸伐昔洛韦缩合反应后的重要中间体，若该中间体中CBZ-D-伐昔洛韦杂质不合格必然导致最终产品盐酸伐昔洛韦中异构体杂质D-伐昔洛韦不合格，故非常有必要建立CBZ-伐昔洛韦中异构体杂质CBZ-D-伐昔洛韦杂质的检测方法。

1 实 验

1.1 仪器与试药

e2695液相色谱仪,Waters；XSE 205电子分析天平,梅特勒-托利多。

CBZ-伐昔洛韦样品(批号：YF01-191208)。甲醇(色谱级)、乙腈(色谱级)、高氯酸钠(AR级)、CBZ-伐昔洛韦对照品(EP杂质E)、CBZ-D-缬氨酸对照品(18-07-1321奥逊生物)。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件[6]

色谱柱以CHIRALCEL-OD-RH-CH(4.6 mm×150 mm，5 μm)为固定相；

流动相A：取2.45 g高氯酸钠，用水稀释至1000 mL(高氯酸调节pH至2.5)；流动相B：90%乙腈；流动相A：流动相B=70:30；

检测波长：251 nm；柱温：35 ℃；流速：0.7 mL/min；进样量：20 μL。

对映异构体不得过3.0%。

1.2.2 溶液制备

对映异构体储备液：精密称定对映异构体对照品5 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

CBZ-伐昔洛韦储备液：精密称定CBZ-伐昔洛韦对照品5 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液：取CBZ-伐昔洛韦样品约25 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

系统适用性溶液：取CBZ-伐昔洛韦储备液1 mL和对映异构体储备液1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

1.2.3 系统适用性

取系统适用性溶液20 μL，注入液相色谱仪，进样6针，记录色谱图。对映异构体与CBZ-伐昔洛韦的分离度最小值为3.7；CBZ-伐昔洛韦峰面积RSD为0.91%，对映异构体峰面积RSD为0.89%。对映异构体与CBZ-伐昔洛韦的分离度均>1.5，CBZ-伐昔洛韦与各色谱峰峰面积的RSD均<5.0%。

2 结果与讨论

2.1 专属性

取空白溶液、供试品溶液、系统适用性溶液、CBZ-伐昔洛韦储备液、对映异构体储备液各20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。

空白溶剂峰不干扰杂质峰，主峰与相邻杂质峰分离度R=3.7>1.5，能有效分离。

图1表明CBZ-伐昔洛韦和其异构体CBZ-D-伐昔洛韦能得到较好的分离，CBZ-伐昔洛韦保留时间约7.1 min，CBZ-D-伐昔洛韦保留时间约9.2 min，二者分离度大于1.5。

图1 CBZ-伐昔洛韦异构体检测方法专属性图谱Fig.1 Specific map of CBZ-valaciclovir isomer detection method

2.2 精密度

供试品溶液：分别6次称取CBZ-伐昔洛韦样品约25 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

取系统适用性溶液、6次的供试品溶液各20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，计算6份供试品溶液中对映异构体含量的RSD。对映异构体含量的RSD为0.3%，RSD≤10%(n=6)。图2表明该CBZ-伐昔洛韦样品中所含异构体杂质为1.2%。

图2 CBZ-伐昔洛韦样品的代表性图谱Fig.2 Representative profiles of CBZ-valaciclovir samples

2.2.1 定量限

样品的制备：对专属性项下各储备液逐级稀释，至信噪比S/N≥10时的溶液浓度即为定量限浓度。

测定：重复进样6针，计算峰面积的RSD。测定结果如下表：

表1 定量限项下对映异构体测定结果统计表Table 1 Statistical table of the results of enantiomer determination under the limit of quantification

对映异构体信噪比S/N最大值为13.6，最小值为10.7，峰面积的RSD为3.9%(n=6)。信噪比S/N均≥10，峰面积RSD≤10%(n=6)。对映异构体定量限浓度为0.06 μg/mL，约相当于样品浓度0.012%。

2.2.2 检测限

样品的制备：对专属性项下各储备液逐级稀释，至信噪比S/N≥3时的溶液浓度即为检测限浓度。

测定：重复进样3针。测定结果如表2。

表2 检测限项下对映异构体测定结果统计表Table 2 Statistical table of enantiomer determination results under the detection limit

对映异构体信噪比S/N最大值为4.4，最小值为3.8；信噪比S/N均≥3。对映异构体检测限浓度为0.02 μg/mL，约相当于样品浓度0.004%。

2.2.3 溶液稳定性

样品的制备：取专属性项下系统适用性溶液和供试品溶液于室温下放置24 h。

测定：分别于0 h、2 h、4 h、8 h、24 h进样，计算系统适用性中各组分峰面积和供试品中对映异构体含量的RSD。测定结果如下表：

系统适用性溶液在室温条件下放置24 h，CBZ-伐昔洛韦峰面积的RSD为0.51%，对映异构体峰面积的RSD为0.42%。

供试品溶液在室温条件下放置24 h，对映异构体含量RSD为0.46%。

表3 溶液稳定性测定结果统计表Table 3 Statistical table of solution stability measurement results

供试品中对映异构体含量的RSD≤15%，系统适用性中各组分峰面积RSD≤5.0%，故系统适用性溶液和供试品溶液于室温下放置24 h溶液稳定。

2.2.4 耐用性

按照专属性项下系统适用性溶液进样一针，按耐用性参数变化表考察：

表4 耐用性参数变化表Table 4 durability parameter variation table

各条件下系统适用性溶液中，主峰与对映异构体分离度不小于1.5。

对柱温和流速进行调整后，主峰与相邻杂质峰及各已知杂质峰之间分离度最小值为3.2，故不同柱温和流速对CBZ-伐昔洛韦中对映异构体的检测影响较小，分析方法耐用性较好。

3 结 论

经方法学验证[7-8]，该方法对CBZ-伐昔洛韦中异构体杂质CBZ-D-伐昔洛韦杂质专属性确认分离度大于1.5，对CBZ-D-伐昔洛韦杂质的检测限为0.004%，在本实验中建立的高效液相色谱法，成功分离了CBZ-伐昔洛韦中的异构体。

综上所述，本文所建立的检测方法简便、准确、有效，能够满足实际样品检测的需要，适用于CBZ-伐昔洛韦中异构体杂质CBZ-D-伐昔洛韦杂质测定，测定结果可靠。原国家标准没有建立异构体检测方法，现采用HPLC方法，提高了产品质量标准，有利于保证产品安全有效。该液相方法的建立为今后的生产过程中对异构体杂质的控制提供了有效的监控手段。