酶标法测定人血清中HIV抗体的不确定度分析

石冬月 辽宁省抚顺市望花区疾病预防控制中心 （辽宁 抚顺 113001）

内容提要： 目的：探究分析酶标法测定人血清中HIV抗体的不确定度。方法：2019年8月～2019年12月根据JJF1059-1999《测量不确定度评定与表示》，采用酶标法测定人血清中HIV抗体，通过HIV抗体检查结果，明确其不确定度，并进行详细分析。结果：资料显示，阴性B=0.28，阴性吸光度值=0.078，cutoff值=0.278。通过cutoff值可将说明书中的批内精密性原始值重新还原成吸光度值。结合微量加样器校准证书可得出，75μ1的相对误差是0.15%，可知不确定度=0.234μ1；结合75μ1微量加样器在试验期间核查的相关数据，可知不确定度=0.341μ1；结合检验规程的规定，每批次检验过程中样品的加样时间均小于30min，可知不确定度=8.66min；结合酶标仪鉴定证书，可知不确定度=0.01。最终可得，样品的吸光度值和cutoff值比值B=4.332，不确定度U=1.2，k=2。结论：通过酶标法测定人血清中HIV抗体的不确定度，可减少假阴性出现几率，可辨别检测质量的影响因素，有利于实验室检测质量的提高。

随着酶联免疫法的飞速发展与在临床的广泛应用，酶标分析仪现今已经基本取代传统的分光光度计，成为临床检测多种病毒、细菌的主要检测手段[1]。临床大量研究[2,3]指出，酶标法具有操作方便、检测快速、结果准确等特点，可在各大医院、疾控中心和血站等场所广泛应用。现今，酶标法多用于乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病等病毒的检测。不确定度是酶标法检测过程中的一项重要指标，也是对检测结果质量的定量表征，不确定度的大小在一定程度上影响到检测结果的可信度大小。因此，在采用酶标法检测人血清中HIV抗体的过程中，为保证检测结果的准确性、可信度，必须检测其不确定度[4]。基于此，本文简单研究分析酶标法测定人血清中HIV抗体的不确定度。

1.资料与方法

1.1 样品

本次研究所采用的样品是模拟HIV抗原抗体阳性混合血清，由弱阳性HIV1型抗体血清+弱阳性HIVP24型抗体血清组合为混合血清。

1.2 试剂

本研究采用的试剂盒出自北京陆桥公司，是通过酶联免疫法检测的人类免疫缺陷病毒抗原抗体诊断试剂盒。

1.3 仪器

本研究所用仪器是产自奥地利的ANTHOS READER 2010型酶标仪、5～50μ1可调移液器、青岛海尔HR40-IIA2型生物安全柜。

1.4 检测方法及过程

在板架上固定所需数量板条，并设置相应的空白对照孔（1孔），孔洞中不添加任何液体；设置阳性对照孔（2孔），在孔洞中添加50μ1阳性液体；设置阴性对照孔（3孔），在孔洞中添加50μ1阴性液体；在其他孔洞中各添加检测样品50μ1。然后将板条全部置入37°C环境下孵育30min，然后去除孔洞中的液体，将提前稀释完毕的洗液注入各个孔洞，静置60s后，摒弃孔洞中的液体，重复清洗6次后，将孔洞拍干，每孔添加50μ1底物缓冲液，然后再加入50μ1底物液，充分振荡混匀后，然后将板条全部置入37°C环境下孵育30min，在每个孔洞中添加50μ1终止液，轻拍混匀后，通过全自动酶免分析仪自动读数，分别读取各个孔洞的OD值。

1.5 统计学分析

采用SPSS 22.0统计学软件对数据进行分析。

2.结果

2.1 测量的数学模型

结合本研究所采用的北京陆桥公司试剂盒说明书中的检测结果计算、测定方法，建立相应的测量数学模型，B（样品吸光度与cutoff值的比值）=S（检测样品的吸光度值）/cutoff值。其中cutoff值=N（阴性对照吸光度值均值）+0.200。由此可得，B=S/（N+0.200）。

2.2 不确定度来源分析

本研究在分析不确定度来源时，从多个方面进行考虑分析，如人员、设备、环境、材料、方法、被测量对象等，不可重复考虑，但也不能遗漏每一个对象。从检测方法原理可看出，B的影响因素有：加样时间、试剂盒批内精密性、加样量、孵育温度、孵育时间、洗板的清洗程度、酶标仪测量等。本次研究严格控制孵育时间、加样时间、孵育温度、加样量、洗板的清洗程度等。从研究结果可看出，以上因素对酶标仪的检测结果影响不大。所以无需考虑引入不确定度。

2.3 评定测量不确定度分量

在评定分析试剂孔的吸光度不确定度时，检测样品吸光度值的不确定度可根据试剂盒批内精密性资料分析，批内精密性可根据实验室试验、说明书、试剂检测报告等方式获取。本研究通过酶联免疫法试剂盒说明书所提供的资料对不确定度进行评定分析，资料显示，阴性B=0.28，阴性吸光度值=0.078，cutoff值=0.278。通过cutoff值可将说明书中的批内精密性原始值重新还原成吸光度值。详情见表1。结合微量加样器校准证书可得出，75μ1的相对误差是0.15%，可知不确定度=0.234μ1；结合75μ1微量加样器在试验期间核查的相关数据，可知不确定度=0.341μ1；结合检验规程的规定，每批次检验过程中样品的加样时间均小于30min，可知不确定度=8.66min；结合酶标仪鉴定证书，可知不确定度=0.01。最终可得，样品的吸光度值和cutoff值比值B=4.332，不确定度U=1.2，k=2。

表1. 批内精密性

3.讨论

现今，酶联免疫吸附试验在人体血清HIV抗原抗体检测中的应用，在各个医疗机构、检验检疫机构、疾病预防控制机构、采血机构等得到了广泛普及。可根据检测结果对HIV感染者进行判定诊断，将实验室检测结果作为诊断依据。而从酶标法检测人体血清HIV抗体的检测结果报告中可以看出，阳性、阴性的判定是根据临界值、检测值的大小进行判断的。当检测值与临界值的数值十分接近时，若不及时考虑不确定度的存在与影响，则会对检测结果的判定造成一定的偏差，有一定几率会把弱阳性标本当成阴性标本。这样既会影响检测报告结果的准确性，又会因漏诊而延误患者的治疗，导致病情迅速发展，还会因未及时进行有效隔离与防护，进一步危害社会公共卫生安全。因此，在酶联免疫吸附试验过程中添加不确定度是非常有必要的，可提高检测试验结果的准确性与科学性。

由上可知，通过酶标法测定人血清中HIV抗体的不确定度，可减少假阴性出现几率，可辨别检测质量的影响因素，有利于实验室检测质量的提高。