原花青素B2同牛胰蛋白酶的相互作用分析

于 湛, 谷笑雨, 祁一萌, 刘佳琪, 张 欣, 刘丽艳, 辛士刚

(1. 沈阳师范大学 化学化工学院, 沈阳 110034; 2. 沈阳师范大学 复杂体系分离与分析辽宁省高校重点实验室, 沈阳 110034; 3. 沈阳师范大学 实验教学中心, 沈阳 110034)

0 引 言

原花青素B2(procyanidin B2,PCB2)是一种典型的B型原花青素(图1)。PCB2广泛分布在茜草科鸡纳树、药樟科锡兰肉桂及钩藤属猫爪钩藤等植物的果皮、树皮等部分[1]。据报道,PCB2可以通过其抗氧化特性改善代谢综合症患者的血脂异常、高血糖和氧化应激状态[2]。PCB2是一种植物来源难溶化合物,人体对其生物利用度较低,因此PCB2进入人体后其含量也较低,较低的含量不利于人们理解这种化合物的生理与药理作用机制[3-4]。迄今,人们尚未了解服用PCB2所带来的益处的生理学机制,但是越来越多的证据表明,PCB2等原花青素对细菌、真菌和病毒有很强的杀灭作用,可以恢复肠道微生物群的活力[5]。动物实验表明,PCB2可以通过调节兔肠道微生物群来预防饮食诱导的肥胖和非酒精性脂肪肝[6]。

图1 PCB2的化学结构Fig.1 Molecular structure of PCB2

胰蛋白酶(trypsin,tryp)是人和动物体内最重要的水解酶之一,原花青素进入肠道后会与tryp接触,因此了解原花青素与tryp相互作用的具体机制,对于了解原花青素对体内生物活性分子的影响、设计新的药物具有重要意义[7]。本文采用荧光猝灭结合分子对接的方法研究了PCB2和tryp之间的相互作用,并分析了二者之间的相互作用类型。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

试剂:PCB2对照品,上海如吉生物公司;牛胰蛋白酶tryp(EC 3.4.21.4),Sigma-Aldrich公司;三羟甲基氨基甲烷(Tris),NaOH,HCl,无水乙醇等均为分析纯试剂;实验用水为超纯水。

仪器:Cary Eclipse荧光光谱仪,美国瓦里安公司;UH5300紫外光谱仪,日本日立公司。

1.2 实验方法

PCB2用无水乙醇配制为1.0×10-4mol·L-1储液备用,tryp用水配制为1.0×10-4mol·L-1溶液备用。Tris配制为pH分别是5.4,6.4与7.4,同时含有0.1 mol·L-1Tris与0.1 mol·L-1NaCl的缓冲溶液。

在一次性离心管内使用移液枪准确移入200 μL tryp溶液,1 mL Tris缓冲溶液及适量PCB2储液,使用超纯水定容至4.0 mL,涡旋混合并经恒温水浴一段时间后,立即进行荧光分析。

荧光光谱仪参数如下:激发狭缝宽度与发射狭缝宽度均为5 nm;λex为280 nm;同步荧光光谱法的恒波长差Δλ为15 nm和60 nm。

利用Autodock 4.2.6软件对PCB2与tryp进行分子对接。tryp结构来自RCSB PDB数据库(PDB ID: 2zq1),PCB2结构来自PubChem,并通过MMFF94分子力场进行结构优化。对接计算所需格子大小、遗传算法种群大小、最大能量评估次数和遗传算法运行次数分别为126×126×126,150,2.5×106和100。分子对接结果使用Protein-Ligand Interaction Profiler(PLIP)[8]分析。

1.3 荧光强度测定

本文所给出的荧光发射数据都经过內滤效应校正[9],内滤效应校正公式为

(1)

其中:Fcorr与Fobs表示校正前后tryp的荧光发射强度;Aex与Aem是PCB2在相同溶液条件下,在激发与发射波长下的紫外-可见吸光度。具体的校正数据见表1。

表1 tryp在不同浓度PCB2存在下的内滤效应校正系数Table 1 The inner filter effect correction factors for tryp in the presence of different concentration of PCB2

2 结果与讨论

2.1 溶液条件对PCB2猝灭tryp的影响

图2 PCB2猝灭tryp的荧光光谱图Fig.2 The fluorescence quenching spectra oftryp by PCB2

蛋白质受溶液pH影响,其高级结构会发生较大程度改变,从而影响与药物小分子的结合能力,因此,本文分别考察了不同pH对PCB2猝灭tryp的影响。分别在pH为5.4,6.4,7.4的Tris缓冲溶液进行荧光猝灭实验后,发现在pH=7.4的条件下,PCB2对tryp的猝灭作用最强。这是由于7.4与tryp的生理pH最接近,tryp在此条件下结构最舒展,也最利于与PCB2结合。

此外,本文还考察了水浴时间对PCB2猝灭tryp荧光发射的影响,结果表明当水浴时间超过30 min后,猝灭现象较为稳定,因此在后续实验中使用30 min水浴。

2.2 PCB2猝灭tryp的机理分析

图2为含有不同浓度PCB2及4.17×10-8mol·L-1tryp的混合溶液的荧光光谱图。从1→7,PCB2的浓度分别为0,6.5,13.0,19.5,29.2,43.8,65.7×10-9mol·L-1。tryp在300～400 nm存在一个强且宽的发射峰,最大发射波长位于341 nm,PCB2对于tryp具有较强的猝灭作用,随着PCB2浓度的增加,猝灭现象愈发显著。

使用Stern-Volmer方程分析影响荧光猝灭的各项因素,Stern-Volmer方程如下所示:

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+Ksv[Q]

(2)

图3 不同温度时PCB2猝灭tryp的Stern-Volmer曲线Fig.3 Stern-Volmer curves oftryp quenched by PCB2under different temperatures

其中:F0与F分别是猝灭剂加入前后荧光剂的荧光发射强度;[Q]为猝灭剂浓度;Kq为双分子碰撞猝灭常数;对蛋白质等生物大分子来说,其平均荧光寿命τ0为10-8s[10];Ksv为Stern-Volmer 猝灭常数。

将前述混合溶液分别置于17,27及37 ℃下水浴30 min,测试其在341 nm处F0/F与[Q]的关系,并将结果示于图3。由图3可见,所有温度下的F0/F与[Q]的关系均属良好线性关系,符合AL型,表明tryp与PCB2是通过形成非共价复合物方式实现荧光猝灭。当[Q]相同时,37 ℃时溶液的F0/F要小于17 ℃时的溶液,即温度越高荧光猝灭越明显,可见复合物的稳定性与温度成反比,这同文献[11]所报道的静态猝灭规律一致。

利用Stern-Volmer方程计算图3中数据,所得结果列于表2。Kq反映了体系中各种分子的扩散和相互碰撞对生物大分子荧光寿命衰减速率的影响,一般小于2.0×1010L·mol-1·s-1,而本文所得Kq值均大于2.0×1010L·mol-1·s-1,进一步表明PCB2对tryp的猝灭是静态猝灭。

表2 不同温度下PCB2对tryp的猝灭常数Table 2 Interaction constants of PCB2 with tryp under different temperatures

当静态猝灭产生时,可使用双对数方程(3)描述主客体之间的结合常数Ka和结合位点数n。

(3)

表3给出了对不同温度下PCB2猝灭tryp荧光发射数据进行双倒数拟合所得结合常数数据,由这些数据可以看出PCB2与tryp所形成的复合物为1∶1型,并且升高温度有利于复合物的稳定性。

表3 PCB2与tryp的结合常数与热力学参数Table 3 The binding constants and the thermodynamic parameters for PCB2 and tryp

根据公式(4)[12]对表3中Ka与T进行线性拟合,计算得到PCB2与tryp结合的ΔH,ΔS及ΔG值,结果表明ΔH与ΔS均为正,但是ΔG为负。

lnKa=-ΔH/RT+ΔS/R

(4)

根据Ross等人[13]对小分子与生物大分子结合的经验规律,PCB2与tryp形成复合物过程是疏水作用所主导的,并且由于该过程的ΔG小于零,因此复合物的形成是一个自发的吸热过程。

2.3 PCB2猝灭tryp的同步荧光光谱分析

为了明确PCB2与tryp的结合位点,本文对复合物分别使用Δλ=15 nm和Δλ=60 nm的同步荧光光谱表征,研究Tyr与Trp等残基的微环境的变化情况。从图4可以看出,随着PCB2浓度的增加,tryp的最大荧光发射位置发生红移,说明tryp的构象发生一定程度改变,Trp,Tyr等残基所在环境的疏水性减弱。并且Δλ=60 nm的同步荧光光谱图中Trp残基的荧光猝灭程度明显大于Δλ=15 nm的Tyr,His,Phe等残基,因此可以初步推测PCB2与tryp的作用位点可能位于Trp残基附近。

(a) Δλ=15 nm; (b)Δλ=60 nm图4 PCB2猝灭tryp的同步荧光光谱图Fig.4 Synchronous fluorescence spectra for the interaction between PCB2 and tryp

2.4 分子对接结果分析

由图5可以看出,PCB2/tryp复合物中存在多个疏水与氢键作用。His57,Gly216,Trp215,Val213,Ser190,Gly219,Tyr228等氨基酸残基在tryp表面形成了一个口袋,PCB2的一个(-)-表儿茶素单元对接在其中,并且与His57,Val213,Trp215残基之间存在疏水作用。此外,PCB2还与His57,Asn97,Ser190,Ser214,Gly216,Tyr228等残基之间存在氢键作用。推测当PCB2在溶液中接触tryp,运动并对接在这个口袋的过程中,Trp215残基附近的化学微环境会发生一定变化,从而影响Trp215结构中吲哚环同其他基团的共轭,最终导致tryp的荧光猝灭。

图5 PCB2与tryp的分子对接结果Fig.5 Molecular docking result of PCB2 and tryp

3 结 语

本文采用荧光光谱法结合分子对接对PCB2猝灭tryp荧光发射进行了系统研究。结果表明,在近生理状态下(37 ℃及pH=7.4条件下),PCB2对tryp具有最为明显的猝灭作用。进一步研究表明,这种猝灭为静态猝灭,即PCB2同tryp之间形成了复合物,并且复合物的形成是一个自发的吸热过程。利用双对数方程计算可知,在37 ℃时复合物的结合常数为1.0×106L·mol-1,结合位点数为1.0。同步荧光光谱研究结果表明,PCB2可能结合在tryp的Trp残基附近。分子对接结果表明,PCB2结合在tryp表面一个疏水性口袋中,并与组成口袋的多个残基之间存在着较强的疏水作用及氢键作用。