一例早发性卵巢功能不全患者的ATG7新发变异分析

尚凌月，杨 熙，王颖忱，张 锋,3，张晓金,3，吴燕华,4

(1. 复旦大学 生命科学学院，上海 200433； 2. 复旦大学附属妇产科医院，上海 200011； 3. 上海市女性生殖内分泌相关疾病重点实验室，上海 200011； 4. 生物科学国家级实验教学示范中心(复旦大学)，上海 200433)

早发性卵巢功能不全(Premature Ovarian Insufficiency， POI)，是一种常见的女性生殖系统疾病，指女性40岁以前出现卵巢功能减退，主要表现为闭经或者月经稀发，促性腺激素水平升高和雌激素水平下降[1]，还常伴有不同程度的潮热盗汗、烦躁易怒等围绝经期症状.

既往研究发现，40岁以前的女性中约有1%面临POI的困扰[2].由于卵巢功能过早衰竭，POI患者不仅面临生育困境，还会出现继发性的多种全身性慢性疾病[3].POI的病因十分复杂，且大部分POI患者病因尚未明确，病毒感染、医源性损伤(如手术、放疗化疗等)、药物影响、自身免疫缺陷、环境因素以及遗传因素等，都可能导致POI.以往的临床研究发现，遗传致病因素占POI病因的20%～25%，在POI的病因学研究中占有重要地位[4].

已有的POI遗传病因研究揭示了一些可能致病的核型异常以及单基因变异.例如，目前普遍认为染色体异常是POI的常见病因，包括X染色体数量异常、X染色体结构异常、常染色体结构异常[3].又如，脆性X综合征相关致病基因FMR1前突变提高POI致病风险[4-7].已报道的可导致POI的单基因遗传变异涉及约60余个基因，患者表型包括综合征型的POI和非综合征型POI.例如BLM[5]，CLPP[6-7]，FOXL2[8]等基因的纯合致病变异可导致综合征型POI，除了POI表型外，患者可伴有生长迟缓和胰岛素抵抗、听力受损、或者眼睑发育不良等症状.又如减数分裂相关基因DMC1[9]，MCM8[10-11]等的纯合致病变异，DNA修复相关基因FANCL[12]、转录调控相关基因FIGLA[13]等的单等位基因致病变异会导致非综合征型POI.

全外显子组测序(Whole-Exome Sequencing, WES)技术是一种新颖的高通量二代测序技术，适用于筛选孟德尔疾病及罕见综合征的致病基因.近年来WES在POI的遗传病因分析中也发挥了重要作用.利用WES技术，在POI家系以及散发患者中已经鉴定出多个新颖的POI致病基因，例如STAG3，SYCE1，SPIDR，HFM1等[2].但是目前临床上仍有半数以上的POI患者病因不明.

本研究利用WES技术以及遗传分析在中国汉族POI患者队列中筛查候选致病变异，发现了一例携带ATG7c.1372G>A(p.V458M)突变的患者.由以往研究可知，ATG7基因缺陷与POI表型关系密切[14-15]，提示本研究发现的ATG7新发突变很有可能是该POI患者的病因.本研究进一步通过Sanger测序、家系回访和生物信息学分析等方法深入探究了该突变致病的可能性.

1 材料与方法

1.1 研究对象

本研究的研究对象由复旦大学附属妇产科医院收集.入组POI患者的标准是： (1) 年龄小于40岁的女性出现≥4个月的月经稀发或者闭经现象；(2) 至少两次，且时间间隔>4周的血清基础卵泡刺激素(Follicle Stimulating Hormone, FSH)>25 IU/L[1]；(3) 无染色体变异、自身免疫病、医源性损伤、腮腺炎病史、环境风险因素影响等.本研究通过了复旦大学附属妇产科医院伦理委员会批准(2017-19)，患者在了解本研究并自愿签署知情同意书后入组.

1.2 基因组DNA(genome DNA, gDNA)提取

使用QIAamp®DNA Blood Mini Kit(QIAGEN，德国)，从患者的外周血中提取gDNA，之后利用Nanodrop仪器测定其浓度和纯度，以及通过琼脂糖凝胶电泳评估抽提的gDNA质量.

1.3 WES及测序结果比对

gDNA样品的WES由艾吉泰康生物科技(北京)有限公司完成.以gDNA为材料构建文库，使用Hiseq X-Ten平台(Illumina，美国)进行测序.在过滤低质量数据后，与参考基因组GRCh37/hg19(2009)进行比对，识别遗传变异位点并进行注释，获得所有捕获区域的遗传变异信息.

1.4 Sanger测序验证

筛选WES结果得到的候选遗传变异，首先根据其在基因组上的位置，通过UCSC网站(https：∥genome.ucsc.edu)获取其上下游序列，以之为模板设计引物，引物应能扩增出包含待验证变异位点在内的、长度在200～1 000 bp之间的PCR产物.引物正向序列为ATGTCTCTGTTTGCTGCCCT，反向序列为TGGCACTATGCTACCAGGTC.使用Golden Star T6 Super PCR Mix(擎科，中国)试剂，通过PCR扩增目的片段.经琼脂糖凝胶电泳后，使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen，美国)凝胶回收PCR产物，随后对产物进行Sanger测序，并使用SnapGene软件查看分析测序结果.

1.5 生物信息学分析

利用SWISS -MODEL网站[16](https：∥swissmodel.expasy.org)模拟蛋白质高级结构.利用PSIPRED网站[17](http：∥bioinf.cs.ucl.ac.uk/introduction/)预测蛋白的二级结构.

2 结 果

2.1 POI患者的临床病理信息

本研究的POI患者1997年出生，初潮年龄是12岁，初潮后的几年月经规律，月经周期为28～31 d，经期4 d，经量偏少.患者从2016年开始出现月经稀发的情况，无其他既往病史，2018年7月27日测得FSH水平为86.51 IU/L，2018年10月12日测得FSH水平为128.39 IU/L，两次连续测量水平高于40 IU/L，被诊断为POI.2018年11月20日B超检查其双侧卵巢偏小，且未发现明显卵泡.详细的临床信息如表1所示.核型分析显示患者的染色体数目和结构均无异常.该患者为独生女，父母均体格健康，且母亲月经规律，目前年龄46岁，未绝经.

表1 携带ATG7突变的POI患者临床病理信息

2.2 WES与遗传变异分析

从患者外周血提取的gDNA，经Nanodrop分析，其浓度大于50 ng/μL，吸光度A260/A280在1.8～2.0之间，A260/A230>1.9，质量较高.琼脂糖凝胶电泳显示gDNA的浓度和条带大小适宜，可用于WES.

WES测序结果经序列比对后，共获得150 709个遗传变异，包括单核苷酸变异(Single Nucleotide Variants, SNVs)和短插入缺失(Insertion-Deletion, InDel).我们设计了POI患者WES测序结果的分析流程，对原始数据进行质量评估后再进行遗传变异筛选，表2显示了具体的筛选流程以及每一步筛选后保留的遗传变异数.具体来说，首先对WES获得的所有遗传变异进行质量评估.其次，去除位于内含子或者距离剪切区域15 bp以外的变异.第三，因为POI的发病率为1%，遗传因素占POI病因的20%～25%，且具有高度异质性，所以本研究中最小等位基因频率(Minor Allele Frequency, MAF)筛选阈值选择为1‰，即保留在千人基因组数据库(1 000 Genome，1KG)[18]、ExAC和gnomAD[19]3个数据库中东亚人群频率均小于1‰的变异.第四，根据突变类型的不同进行有害性评估.筛去同义SNVs；通过SIFT[20]、PolyPhen-2[21]、MutationTaster[22]、CADD[23]4种算法预测错义SNVs的有害性，保留4种软件均认为有害的SNVs；直接保留其他功能丧失型突变，包括无义突变、终止密码子丢失、移码或者非移码的InDel以及剪切位点变异.最终得到39个候选的致病性遗传变异(表2)及相应基因.

表2 WES数据筛选流程及结果

对39个候选基因及变异进行文献调研，包括POI患者的临床报道、动物模型和该基因的功能实验，综合评估每个遗传变异的致病可能性.最终发现一个已知POI致病基因的新变异，即ATG7 c.1372G>A(p.V458M)(表3).ATG7，即自噬相关基因7(autophagy-related 7)，参与细胞自噬调节.已有的小鼠模型研究表明条件性敲除ATG7导致小鼠生育力下降[14]，此外ATG7的杂合错义突变可能诱发POI[15].综合前人的研究，我们认为本研究发现的ATG7杂合错义突变很可能也是该位患者的遗传学病因.

表3 一例POI病人中发现的ATG7突变的信息

1)ATG7的GenBank转录本编号是NM_006395；2) 等位基因频率指突变的等位基因在1KG Project、ExAC和gnomAD数据库东亚人群中的频率；3) 利用SIFT、PolyPhen-2、MutationTaster和CADD 4个软件评估突变的功能.

2.3 ATG7杂合错义变异的验证

为排除WES结果假阳性，我们利用Sanger测序进行变异验证.针对突变位点，我们设计了用于Sanger测序的引物，确定发现的ATG7的突变是真实存在的变异，测序结果如图1(a)(见第440页)所示.进一步通过回访获得其父母样本进行测序，确定父母的基因型.结果发现患者携带的ATG7变异是新发变异，健康父母均未携带该变异(图1(b)，见第440页).根据美国医学遗传学和基因组学会(American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)发布的序列变异解读标准与指南[24]，参考其中对于致病或可能致病的变异分类的标准进行评分，4种生物信息学功能预测软件均预测该变异有害，该变异在东亚人群数据库中缺失.患者携带的变异为新发变异，父母不携带该变异且表型健康，共计符合1个支持(PP3)和2个中等(PM2、PM6)的致病性证据标准，该变异属于可能致病(likely pathogenic).

图1 POI患者以及其父母ATG7基因型Fig.1 The ATG7 genotype of the POI proband and her pedigree(a) ATG7基因的Sanger测序.WT为野生型，M为c.1372G>A突变型，箭头指向突变位点.(b) POI患者家系图.实心圆圈表示POI患者，黑色箭头指向先证者，空心圆圈表示正常女性，空心方块表示正常男性.

2.4 变异位点的有害性分析

我们进一步结合生物信息学手段在蛋白质水平评估ATG7基因c.1372G>A(p.V458M)的有害性.首先，变异改变的氨基酸位点在斑马鱼、鸡、哺乳动物等中均保守(图2(a)).其次，利用SWISS -MODEL模拟构建ATG7蛋白的三维结构，发现p.V458M变异位于其α-螺旋的位置(图2(b))；利用PSIPRED 4.0预测蛋白质二级结构发现，p.V458M变异位于α-螺旋形成起始部位(图2(c))，可能对于其α-螺旋的形成具有重要作用.第三，变异氨基酸位点同报道的POI致病性ATG7变异c.1209T>A(p.F403L)相近，都位于蛋白保守的E1-like区域(图2(d))，该区域可能起源于古老的原核生物合成途径，ATG7利用该区域作为支架形成同源二聚体[25-26].

图2 ATG7变异分析Fig.2 Genetic analysis of the ATG7 variant(a) 突变位点保守性分析.红色V表示错义突变的位点所在氨基酸.(b) 突变位点在蛋白模型中的位置分析.红框以及放大区域表示出突变位点对应氨基酸所在的位置.(c) 突变所在位置的二级结构分析.红框标出突变所在位置.蓝色方框表示预测的可信度，颜色越深可信度越高.(d) 突变位点所在基因组及蛋白质结构域位置分析.橙色箭头指向已报道的突变位点，蓝色箭头指向本研究所报道的突变位点.蓝色方框为蛋白质的E1-like区域，包括354～510位氨基酸.

3 讨 论

卵巢是女性生殖系统的性腺，是卵细胞发育的场所，具有生殖和内分泌的重要功能.人类女性在出生前后，卵巢中的每个初级卵母细胞均被单层扁平上皮细胞包围，形成相互独立的始基卵泡(primordial follicle)，它们构成了女性一生的生殖储备池.进入青春期后，每个月会有15～20个左右的始基卵泡被激活，卵母细胞重新启动减数分裂，优势卵泡发育成熟并排卵.卵巢储备池中的卵泡数量随着女性年龄的增加而不断下降，直至完全耗竭，女性会发生自然闭经[27].POI严重影响了女性的生理周期和生育力，如果患者患病较早，甚至可能不育[28].揭示POI病因对于保护女性健康，减少对生育力的威胁具有重要意义.本研究通过WES技术对POI患者的遗传病因进行探索，发现一位携带ATG7基因杂合c.1372G>A(p.V458M)突变的患者.结合以往ATG7和POI的临床报道和动物模型研究，以及对变异位点进行一代测序和生物信息学分析后，我们认为筛选得到的ATG7变异很可能是该患者的致病原因.

自噬以及构成自噬核心机制的蛋白质成分从酵母到哺乳动物中都是高度保守的.细胞自噬主要有3种形式： 巨自噬(macroautophagy，自噬的最主要形式，以下简称自噬)、微自噬(microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy)[29].哺乳动物自噬核心途径起始于双层膜结构的吞噬泡的形成，至少有5组蛋白分子参与其中，包括： (1) Atg1/ULK(unc-51-like)激酶复合物；(2) Beclin1/PI3K(phosphatidylinositol 3-kinase)复合物；(3) 两种跨膜蛋白Atg9和VMP1(vacuole membrane protein 1);(4) 两个泛素样结合系统Atg12和Atg8/LC3；(5) 介导自噬体和溶酶体融合的蛋白.其中Atg7参与两个泛素样结合系统，该系统是吞噬泡扩展延伸所必须的[30].Atg7是非经典的同源二聚体E1酶(E1 enzyme)，可与非经典的E2酶Atg3相互作用，在自噬过程中介导泛素样蛋白Atg8的结合从Atg7转移到Atg3，在这个过程中Atg8依次被Atg7和Atg3激活[25,31].

2019年，Delcour等在高加索人群散发性POI样本中分别发现了自噬相关基因ATG7和ATG9A的杂合错义突变各1例，功能研究进一步发现错义突变导致了细胞自噬能力下降，是诱发POI的可能遗传机制[15].此外，早期研究显示一些自噬相关基因的纯合缺失小鼠无法存活.例如，Atg7纯合缺失的小鼠在出生后一天内死亡[32]；Beclin1纯合缺失小鼠在胚胎期就已经死亡[33].2011年Gawriluk等[34]发现卵巢自噬功能受损会影响卵母细胞的存活，具体表现为出生一天后，Beclin1杂合敲除小鼠卵巢的生殖细胞比对照组减少了56%，而Atg7纯合缺失小鼠卵巢在这一时期亦没有可辨认的生殖细胞[34].这些工作提示了自噬基因与雌性生育力之间的潜在联系.2015年Song等[14]在雌性小鼠的生殖细胞中特异性敲除Atg7，小鼠产仔数比对照组减少了约63%，并且发现这种小鼠第一胎可育且产仔数与对照组无明显差异，但是随后每窝产仔数突然减少或变得完全不育.组织学研究发现，虽然在受精后17.5天时条件性敲除Atg7小鼠与对照组的卵母细胞数量无明显差异，但是在出生3天后观察到卵母细胞的过度丢失，表明自噬可能是新生儿期生殖细胞存活所必需的.经过体外模拟新生儿卵巢发育过程，该研究还表明自噬机制正确调控可减少卵巢生殖细胞过度丢失.哺乳动物新生儿出生后即面临严重的饥饿状态，此时器官会诱导自噬、通过自体蛋白的降解来生产氨基酸，以维持能量稳态[35].在小鼠饥饿模型中进一步发现，对新生小鼠进行饥饿处理会诱导卵巢中卵母细胞自噬水平上升，卵母细胞和体细胞凋亡增加，延迟始基卵泡池的建立[36].由此推测，哺乳动物出生时可能需要正常的自噬功能帮助克服早期的饥饿阶段，也从而保护卵母细胞出现过度丢失.

本研究发现的杂合ATG7变异属于新发突变，有两种可能的遗传模式： 单倍体不足或者突变的显性负作用.错义突变可能会影响蛋白质表达水平或mRNA稳定性，从而导致单倍体不足.另一方面，因为ATG7发挥功能需要形成同源二聚体[25-26]，而p.V458M变异位于α-螺旋的关键位置，可能影响二聚体的形成与功能，发挥显性负效应.进一步的遗传模式分析还有赖于深入的分子生物学实验.

综上，本研究在一位中国汉族POI患者中鉴定出一个ATG7杂合错义变异.这是迄今为止在POI患者中发现的第二个致病性ATG7遗传变异，再次提示了自噬对于女性卵巢储备的重要性，并丰富了POI的遗传病因.