本源菌降解褐煤的生物学特性及微观结构分析

牛 显，牛 煜，索永录

(1.西安科技大学 能源学院，陕西 西安 710054；2.内蒙古工业大学 矿业学院，内蒙古 呼和浩特 010051；3.山西大学 电力与建筑学院，山西 太原 030006)

0 引 言

褐煤占中国煤炭总储量的13%以上，已探明可采储量约1 300亿t[1]。然而，环境污染大和应用价值低的现状严重制约了褐煤产业的发展[2-3]。褐煤的微生物降解转化技术以其环境友好、反应温和、成本低廉、产物用途广等优势[4]，已成为当前研究热点。

自20世纪80年代以来，德国FAKOUSSA和美国COHEN分别报道了真菌可以在煤上生长并将其转化为黑色水溶物[5-6]。此后，大量学者集中于煤种、菌种、机理和产物等4个方面的研究。在煤种方面，SCOTT等指出煤种和煤样的氧化预处理会影响真菌类对其的溶解性，氧化程度高的煤易被降解[7]；也有学者利用光-氧氧化、过氧化氢、硝酸、氢氧化钠和紫外光照等氧化预处理方法，都不同程度的使煤炭的生物降(溶)解率得到了提高[8-12]。在菌种和机理方面，STRANDBERG等报道了外源放线菌能够产生胞外碱性物质溶解煤炭，生成黑色液体，而且溶解度随pH值的升高而增大[13]。QUIGLEY等评价了9种外源微生物对煤炭的降解情况，并发现胞外碱性产物是煤样降解的原因[14]；RALPH等系统的研究了外源真菌黄孢原毛平革菌，证实了其分泌的氧化酶(木质素过氧化酶、锰过氧化酶、漆酶)能够降解煤中部分大分子[15]；COHEN等研究外源担子菌云芝的溶煤活性，发现产生草酸能够螯合煤中多价金属离子[16]；袁红莉等发现了具有降解褐煤的外源斜卧青霉菌，并证实了分泌的酯酶对褐煤有解聚作用[17-18]。在产物方面，主要研究了产物组成、产物结构、溶解度、分子量、酸沉淀性质、吸光度、蛋白质含量、发热量以及产物应用领域等[19-21]。

以上研究中学者们更多地关注于外源菌，忽略了外源菌很难适应原位复杂的煤层环境而存活，其高效的降解性无法实现的问题。以原位褐煤中筛选本源菌为切入点，研究了本源菌F.spp.NF01生长曲线、pH-t曲线和固液态降(溶)解褐煤的生理学特性，表征了菌株降解后残煤的形貌、官能团、自由基，旨在补充原位煤层中本源菌降(溶)解褐煤方面的数据，为推进本源菌对褐煤降解特性研究发展起到积极作用。

1 材料与方法

1.1 煤样

筛选本源菌株的褐煤煤样采集于内蒙古自治区赤峰市元宝山煤田的6家煤矿西二采区北三段6-8工作面。先用灭菌取样铲铲去工作面已裸露煤炭，然后利用灭菌取样器(1 000 mm×25 mm)快速插入新揭露的煤壁取样，装入无菌袋密封，4 ℃保温箱运输，如图1所示。其中，取样器常被用做土壤和粮食取样。

图1 采样工具

原煤样采集于地面煤场不同方位的褐煤，用编织袋密封保存。利用颚式破碎机和密封式制样粉碎机逐步粉碎，并用SDNS 200a标准振筛机筛分成粒径200目(0.074 mm)颗粒。预处理煤样是按1 g煤与10 mL 1 mol/L NaOH的比例混合，48 h后抽滤洗涤至中性，烘干，牛皮纸包好备用。

1.2 真菌的分离与鉴定方法

1.2.1 真菌的分离方法

基本培养基MM：3 g/L KH2PO4，1.5 g/L MgSO4·7H2O，1 g/L(NH)2SO4，0.1 mg/L FeSO4·7H2O，0.2 mg/L CuSO4·5H2O，0.68 mg/L ZnSO4，pH调至中性，配固体培养基加1.5% Agar。

G为10 g/L葡萄糖；M为10 g/L麦芽糖；SGC为10 g/L葡萄糖酸钠。

在超净工作台中，将筛选本源菌的褐煤煤样加入灭菌的100 mL MM-GM(基本培养基加入G和M的碳源)培养液中，28 ℃150 rpm，富集培养3 d。将富集菌液1 mL转接到100 mL MM-GM培养液且加有1 g灭菌的原煤样中，筛选7 d，再经多次富集培养和平板分离，得到一株真菌NF01，并用20%甘油-70 ℃保存。

1.2.2 真菌的鉴定方法

真菌NF01通过平板培养和扫描电镜的形态学观测，结合ITS测序，完成菌种的鉴定。其中，扫描电镜样品的制备如下

1)灭菌盖玻片45°插入固体培养基，让菌株爬片生长；

2)取长有菌丝的盖玻片，2.5%戊二醛4 ℃固定48 h；

3)磷酸缓冲液(pBS)漂洗3次，以30%，50%，70%，80%，90%，100%Ⅰ，100%Ⅱ浓度的乙醇梯度脱水，15 min/次；

4)75%叔丁醇，100%叔丁醇各15 min；置冰箱冷冻室固化，抽真空干燥，喷金观察。

测序步骤如下

1)刮取培养7 d的平板上菌丝50 mg，液氮研磨后转移至EP管中，利用试剂盒SK8259对真菌基因组DNA抽提；

2)凝胶电泳检测抽提DNA是否成功；

4)取PCR扩增产物5 μL用2%琼脂糖凝胶电泳检测，判断扩增是否成功；

5)将菌株ITS序列通过NCBI数据库的BLAST进行同源性序列比对，得到相关的同源性菌株信息。

1.3 真菌NF01的特性分析

1.3.1 真菌NF01的生长曲线

在超净工作台中，将1 mL真菌NF01的菌液量分别转接到24瓶装有灭菌的100 mL MM-SGC培养液烧瓶中，28 ℃150 rpm摇床培育8 d。每24 h，取出3个烧瓶，离心，洗涤，收集菌丝，烘干，称取菌丝干重。

1.3.2 真菌NF01生长液的pH值

或“言必称西”，“呲必中国”；或讲社会主义制度则“完美无缺”，讲资本主义制度则“一无是处”，不是运用马克思主义的唯物辩证法分析问题。

在超净工作台中，将1 mL真菌NF01的菌液量分别转接到3瓶MM-SGC(100 mL)培养液中，28 ℃150 rpm摇床培养8 d。空白组MM-SGC(100 mL/瓶，共3瓶)为不接真菌。每天分别取3 mL菌液，离心，吸取上清液置于试管，用赛多利斯PB-10检测仪测pH值。

1.3.3 真菌NF01降(溶)解褐煤

在超净工作台中，将真菌NF01接种到MM-SGC固体培养基上，28 ℃恒温避光培养3 d。3 d后，将灭菌的原煤样(0.5±0.000 5 g，200目)和预处理煤样(0.5±0.000 5 g，200目)置于固体培养基菌丝上，观察褐煤的溶解情况。

1.3.4 真菌NF01的褐煤降(溶)解率

配置100 mL MM-SGC培养液18瓶，9瓶/组，共2组。第1组接种1 mL真菌NF01的菌液和添加预处理褐煤，第2组不接种菌液仅添加预处理褐煤，28 ℃150 rpm摇床培育。每组在第3天、第5天、第7天分别取出3瓶，测pH值，离心，多次洗涤，收集褐煤，烘干，称取干重，利用如下公式计算褐煤降(溶)解率。

式中Lbr为褐煤生物降(溶)解率，%；M0为降(溶)解前褐煤质量，m；m1为降(溶)解后的褐煤质量，m。

1.4 真菌NF01降解褐煤的表征

配置100 mL MM-SGC培养液6瓶，3瓶/组，共2组。第1组中分别接种真菌NF01且加入1.0±0.000 5 g灭菌的预处理褐煤，记“Ⅰ-残煤”代表；第2组中不接种真菌NF01，但分别加入1.0±0.000 5 g灭菌的预处理褐煤，记“Ⅱ-残煤”代表。在28 ℃150 rpm摇床中，培养7 d，离心，洗涤3次，收集残煤，烘干备测。

1.4.1 褐煤的形貌

用扫描电镜JSM-7900F对原煤样、Ⅰ-残煤和Ⅱ-残煤进行测试，分析煤样降解前后形貌变化特征。样品先干燥30 min，然后用导电胶粘附样品在检测台上，喷金10 s，放大10倍-500 000倍，加速电压0.01～30 kV。

1.4.2 褐煤的红外光谱

利用红外光谱Nicolet iS50对原煤样、Ⅰ-残煤和Ⅱ-残煤煤样官能团进行测定分析。先将测试样品和溴化钾真空干燥，分别取煤样各1 mg与100 mg纯KBr研细混合，研磨到粒度小于2 μm，HY-12型粉末压片机压成透明薄片。光谱仪分辨率4 cm-1，扫描32次，测定范围4 000～400 cm-1。

1.4.3 褐煤的自由基

用电子顺磁共振EMXPLUS10/12对原煤样、Ⅰ-残煤和Ⅱ-残煤煤样进行自由基测定，分析自由基浓度Ng、朗德因子g值和线宽ΔH参数。微波频率分别为9 839，9 837和9 843 MHz，微波功率0.2 mW，中心磁场351 mT，扫描宽度10 mT，调制频率100 kHz，调制振幅0.1 mT，时间常数0.01 ms，扫描60 s。

2 结果与讨论

2.1 真菌鉴定

从图2可以看出，真菌NF01培养3 d后，菌落直径2.5～3.1 cm，气生菌丝为白色絮状、无隔透明、质密突起。小型分生孢子为单生，无隔，数量多，形态多为卵形、椭圆形，大小2.67-7.55×0.89-1.83 μm；大型分生孢子散生于气生菌丝上，数量少，无隔，形状多为长筒形，大小8.33-12.5×1.66-2.5 μm；产孢细胞类型为简单瓶梗。

图2 真菌NF01的形态学特征

真菌NF01测定的ITS序列519 bq已录入NCBI GenBank数据库，登录号MN822700。通过BLAST进行相似性比对，发现Fusariumproliferatum(MK226301.1，MK226291.1，MK020694.1)、Fusariumsp(MK250069.1，MH050788.1，MH511574.1)、Fusariumfujikuroi(MK166052.1，MH911404.1，MH282573.1)和Fusariumverticillioides(MF882928.1)相似度均为100%，鉴定属于镰刀菌属。

根据菌株形态学特征，检索《真菌鉴定手册》《中国大型真菌》中描述各种真菌的形态，结合测序鉴定结果，菌株NF01属于镰刀菌属(FusariumsppNF01)。镰刀菌环境适应能力很强，严寒的北极和炎热的沙漠中都有发现，并且据已有研究，其具有降(溶)解褐煤[22]和去除挥发性有机化合物及多环芳烃的能力[23]。在原位煤层中发现镰刀菌，说明其具备适应原位复杂煤层环境的优势，为褐煤的本源菌降解研究起到重要意义。

2.2 F.spp.NF01生长曲线、pH-t曲线及降(溶)解褐煤实验

从图3可以看出，在生长曲线中，前3天的真菌F.spp.NF01生长为对数生长期，第3天的菌体干重达到了0.142 g峰值，从第4天开始，菌株生长进入相对平稳期。在pH-t曲线(有菌)中，随着真菌F.spp.NF01生长，pH值逐渐增大，菌液呈现出碱性。第3天菌液pH值相对于最初pH值，增长率达到了25.1%，从第4天开始，pH值增幅相对平缓，最大pH值为第7天的9.28；而pH-t曲线(无菌)的空白组，pH均值为6.92，变化不大，菌液仍显中性。这说明生长于MM-SGC培养液的真菌F.spp.NF01能够分泌碱性物质，使菌液呈现出碱性环境。

图3 F.spp.NF01的生长曲线和pH曲线

从图4可知，煤粉在放置菌丝上培养3 d后，左侧预处理煤粉出现了黑色液滴，0.5 g煤粉完全被降(溶)解，而右侧原煤粉没发现黑色液滴，未被降(溶)解。这说明6家煤矿褐煤可以通过预处理实现F.spp.NF01菌丝的降(溶)解，预处理破坏了褐煤结构使菌株更容易降(溶)解褐煤。

图4 F.spp.NF01降(溶)解褐煤

从表1可知，第1组中，第3天含煤菌液的pH值7.2增至7.87，褐煤的降(溶)解率是7.46%，第5天，随着pH值逐渐增大，褐煤降(溶)解率也逐渐增大，达到18.14%，第7天，pH值达到9.41，较最初pH值7.2，增幅30.7%，降(溶)解率也增至27.9%。第2组中，pH值没有变化，呈现中性，褐煤只有少量减少。相对于无煤的生长液pH值，有煤菌液前3天pH值增幅不大，但第7天pH值则有较高增幅。说明在菌株生长前期，褐煤的存在对菌液pH值增加有抑制，生长后期，有促进作用。

表1 褐煤的降(溶)解率及pH值

经数据分析发现，真菌F.spp.NF01生长在含褐煤的MM-SGC培养液中能够使菌液呈现碱性环境，伴随着菌液pH值的升高，褐煤降(溶)解率也逐渐增大，褐煤降(溶)解率与菌液pH值存在正相关性。碱性的生长液使褐煤表面的酸性基团离子化，如褐煤中含有可溶于碱液内的腐殖酸[13-14]，从而改变褐煤的亲水性，提高降(溶)解率。因此，菌株产生的碱性物质参与了褐煤的降(溶)解。

2.3 褐煤的表面形貌

从图5(a)和图5(b)可知，原煤样表面形貌相对平整，经无菌培养液摇床7 d后的NaOH预处理煤样(Ⅱ-残煤)表面离散颗粒增多，且变得起伏粗糙。而有菌株作用的煤样(Ⅰ-残煤)表面颗粒变得更小，起伏更大，且出现了较多的裂隙结构，如图5(c)所示。这说明相对于原煤样和无菌株作用的预处理煤样，有菌株作用的预处理煤样表面形貌变化更大，煤样表面形貌的改变与真菌F.spp.NF01的参与有关。

图5 褐煤的形貌

2.4 褐煤的红外光谱

从图6可以看出，虚垂线标记的11处原煤样、Ⅰ-残煤和Ⅱ-残煤煤样红外光谱的吸收峰强度和峰形有明显的差异。褐煤官能团的红外吸收峰频率特征，见表2。

表2 褐煤官能团的红外吸收峰频率特征

图6 褐煤的红外光谱

2.5 褐煤的自由基

从图7(a)和图7(b)所知，Ⅱ-残煤、原煤样和Ⅰ-残煤的EPR波谱对称性峰和自由基浓度依次增大。相比于原煤样，Ⅱ-残煤自由基浓度减少，说明预处理过程中自由基活性位点逐渐减少。在红外光谱中，Ⅱ-残煤羟基官能团的增多，可能与自由基位点被含氧官能团消耗有关。而对于原煤样和Ⅱ-残煤，菌株作用后的Ⅰ-残煤，自由基浓度增大，说明菌株作用过程中发生了褐煤结构的改变，使其结构中的弱键断裂并张开，以及芳香族结构单元间桥键和侧链的断裂，使小分子自由基含量逐渐增加，自由基浓度升高。

从图7(c)可以看出，相比于原煤样，Ⅱ-残煤朗德因子g值增大可能与煤中含有的自由基种类、杂原子等有关。而对于原煤样和Ⅱ-残煤，Ⅰ-残煤自由基g值的增大可能是产生较多小分子自由基中的杂质成分有关，如氮、硫和一些金属自由基。因为g值是表征分子内部结构特征的量，代表着不同的自由基种类。已有研究可知，碳原子为中心的自由基g值较小，过氧化、含硫类及金属离子络合物自由基g值偏大[30-31]。PETRAKIS研究了自由基g值，并总结出含氮自由基g为2.003 1，含硫自由基g为2.008 0～2.008 1，这些杂原子自由基对g值有影响[32]。这与高阶煤(无烟煤)含杂原子少，g值偏小的结果相一致。

从图7(d)可知，Ⅰ-残煤煤样谱线宽明显偏大，相对于Ⅱ-残煤和原煤样。这说明该菌株作用褐煤过程中，形成了大量小分子自由基，电子自旋减弱，弛豫时间缩短，导致谱线宽度逐渐增大。

图7 褐煤的自由基

3 结 论

1)原位煤层中分离得到一株真菌，通过形态学特征和ITS测序鉴定，菌株为镰刀菌属。菌株F.spp.NF01分离与鉴定进一步丰富了降解褐煤的本源菌库，为褐煤的生物降解研究提供了有价值的菌属信息。

2)F.spp.NF01生长于MM-SGC培养液中呈现碱性，pH值最高达9.41，生长6 d的菌丝可完全降(溶)解0.5 g预处理褐煤，且预处理褐煤的降(溶)解率，随着含煤菌液pH值的升高而增大。菌株产生的碱性物质参与了褐煤的降(溶)解。分析得到的生物学特征结果是剖析碱作用机理的重要数据，将为揭示碱作用机理研究起到积极作用。

3)褐煤的表征说明了F.spp.NF01可以降解预处理褐煤，使其表面形貌、官能团和自由基发生改变。在形貌上，表面变得更加粗糙，结构增多。在官能团上，芳环侧链基团、醚键、碳碳双键、脂肪族甲基和亚甲基等官能团吸收峰强度减弱。在自由基上，自由基浓度、朗德因子g值和线宽ΔH增大。残煤微观结构表征丰富了褐煤生物降解产物的研究，推进了降解产物的增值研究工作。