基于网络药理学的白鲜皮抑菌活性成分研究

李 莎，董洲君，韦 洁，陈星仪，王新智，王文豹(齐齐哈尔医学院 药学院，齐齐哈尔 161006)

皮肤感染，是细菌和真菌感染性皮肤病.目前，在临床应用中，西医治疗皮肤病主要采用抗过敏法，在初期控制病情的效果较好，但具有不良反应大、停药后易复发等缺点[1].在我国药典中，复方中将白鲜皮与苦参配伍作为治疗药物的就有20多处，其中大多数是治疗皮肤病，且白鲜皮既可内服，也可外用.内服煎汤，外用煎水洗或研末敷[2]，使用方法多样.现代研究结果表明，白鲜皮具有抗菌、抗炎及抗过敏等药理作用[3-4]，可用于湿热疮毒和湿疹等症[5-6].

中药具有多成分、多靶点、多途径的作用特点，在研究其治疗疾病的分子机制存在一定困难.如今，一些市售药膏如：狼毒抑菌乳膏，克痒舒洗液等具有抗菌作用的药物中也都含有白鲜皮，但白鲜皮中具体是哪一种成分或哪些多成分协同发挥了抗菌作用，尚且不详.网络药理学基于“疾病-靶点-药物”相互作用网络，是发现中药生物活性成分和作用机理的一个有效工具，它从整体角度阐释了中药的药理机制[7-8].本研究运用网络药理学方法，分析白鲜皮抑菌的物质基础和作用机制，希望为之后的深入研究及应用提供帮助.

1 实验方法

1.1 对中药白鲜皮化学成分的收集

白鲜皮化学成分的收集来源于中药系统药理学数据库与分析平台(http://lsp.nuw.edu.cn/tcmsp.php)[9]、中国知网和万方数据库.

1.2 通过PubChem检索化学成分的Canonical SMILES

利用有机小分子生物活性数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)得到各化学成分的SMILES[10].

1.3 利用Molinspiration Property Calculator查看白鲜皮化学成分的分子性质

由有机小分子生物活性数据库得到的SMILE，输入至Molinspiration Property Calculator网站中(https://www.molinspiration.com/cgi-bin/properties)，预测各化学成分的相对分子质量(Mr)、氢键供体数(HBA)、氢键受体数(HBD)、油水分配系数值(logP)和可旋转键个数(NROTB)等性质.

1.4 对比类药五规则筛选出有效化学成分

Lipinski类药五规则是由Christopher A·Lipinski提出的筛选类药分子的五条基本规则，符合类药五规则的化合物会有更好的药代动力学性质，在生物体内代谢过程中会有更高的生物利用度，因而也更有可能成为口服药物.类药五原则：1)Mr小于500；2)HBD小于5；3)HBA小于10；4)logP小于5；5)NROTB不超过10个.

1.5 通过SwissTargetPrediction预测白鲜皮有效成分的潜在靶点

Swisstargetpredict(http://old.swisstargetprediction.ch/)是用于生物活性小分子目标预测的网络服务器.本研究采用SwissTargetPrediction在线分析工具，预测白鲜皮中活性成分的作用靶点.将各成分的SMILES文件导入SwissTargetPrediction在线靶点筛选平台，预测各成分作用靶点.在筛选过程中，限定筛选潜在靶点的对应物种为“人”，获得潜在靶点统计表，取前五个相关性强的靶点进行进一步研究.

1.6 通过Uniprot蛋白数据库筛选白鲜皮有效成分对应的有效靶点

UniProt(Universal Protein，https://www.uniprot.org/uniprot/Q9NYW0)是信息最丰富、资源最广的蛋白质数据库，由Swiss-Prot、TrEMBL和PIR-PSD三大数据库的数据组成.其数据主要来自于基因组测序完成之后获得的蛋白质序列，还包含了大量来自于文献中报道的蛋白质的生物功能的信息.

1.7 白鲜皮活性成分与作用靶点的网络构建与分析

网络药理学是运用网络分析技术，对选取的特定信号与多靶点进行分析，预测它们之间的潜在联系，并形成网状视图.我们基于网络药理学使用Cytoscape 3.7.0软件构建白鲜皮活性成分-作用靶点网络分析.

2 实验结果

2.1 白鲜皮化学成分的收集

通过检索中药系统药理学数据库与分析平台(http://lsp.nuw.edu.cn/tcmsp.php)、中国知网和万方数据库，共收集到110个化学成分.

2.2 对比类药五规则筛选出有效化学成分

根据类药五规则，对白鲜皮中的化学成分进行筛选，最终有58个分子符合类药五规则，见表1.

表1 经类药五规则筛选后的白鲜皮有效化学成分

续表1

2.3 通过SwissTargetPrediction预测白鲜皮有效成分的潜在靶点

采用SwissTargetPrediction在线分析工具，预测白鲜皮中58个活性成分的作用靶点，取前五个相关性强的靶点进行进一步研究.

2.4 通过Uniprot蛋白数据库筛选白鲜皮有效成分对应的有效靶点

将上一步得到的靶点依次输入，得到其生物功能，并根据显示的信息和查阅文献来筛选与抗菌活性有关的靶点，由此筛选得到白鲜皮有效化学成分的作用靶点，见表2.

表2 白鲜皮活性成分抑菌的直接作用靶点

2.5 白鲜皮活性成分与作用靶点的网络构建与分析

白鲜皮的活性成分-作用靶点网络图见图1，菱形表示化学成分，圆形表示靶点，每条边代表成分和靶点的相互作用，节点大小与度值成正比例关系，共包括27个成分，20个靶点，41条边，47个节点，平均degree为4.3，其中degree排名前4的成分是Calodendrolide，叶含狭叶香茶菜素(Angustifolin)，柠檬苦素(Limonin)，吴茱萸苦素(Rutaevin).蛋白靶点的相关信息及度值，见表3.由Cytoscape3.7.0的network analyzer分析得可，度值大于平均值的关键靶点有9个，分别为：①磷脂酰肌醇4，5-二磷酸3-激酶催化亚单位δ异构体(PIK3CA)；②组织蛋白酶L1轻链(CTSL1)；③酪氨酸蛋白磷酸酶非受体2型(PTPN2)；④m期诱导剂磷酸酶1(CDC25A)；⑤麝香猫样蛋白1(MBNL1)；⑥前列腺素G/H合酶2(PTGS2)；⑦巨噬细胞移动抑制因子(MIF)；⑧花生四烯酸5-脂氧合酶(ALOX5)；⑨m期诱导剂磷酸酶2(CDC25B)，推测白鲜皮的有效成分是通过上述靶点来发挥抑菌作用的.

图1 白鲜皮活性成分-靶点网络图

表3 相关靶点的信息及度值

续表3

3 讨 论

中药具有多成分、多靶标和多途径协同作用的特点，因此，很难阐释清楚其治疗疾病的物质基础和作用机制，而网络药理学的出现为中药的现代研究提供了全新的思路[11-12].

本研究构建了白鲜皮中与抑菌相关的化合物-潜在作用靶点网络，共包含27个化合物和20个作用靶点，可见白鲜皮发挥抑菌作用具有多成分和多靶点的特点.研究结果显示白鲜皮中具有抑制细菌作用的化学成分可能是Calodendrolide，叶含狭叶香茶菜素(Angustifolin)，柠檬苦素(Limonin)和吴茱萸苦素(Rutaevin)等，这些成分可能通过PIK3CA，ALOX5，ALOX15，PTGS2等靶标起治疗作用.

磷脂酰肌醇4，5-二磷酸3-激酶催化亚单位δ异构体(PIK3CA)在肥大细胞发育和肥大细胞介导的过敏反应中起重要作用.有研究结果表明，组胺过敏引起的肥大细胞激活脱颗粒释放出的炎症介质之一，能够引起皮肤瘙痒[2].结果显示Skimmianine，Haplopine，Dictamdiol A，Dictamdiol B，Isodictamdiol和Dasycarpol同时作用于PIK3CA，推测白鲜皮的抑菌作用与这6个活性成分同时调控PIK3CA的表达有关.前列腺素类生物合成途径中的双重环氧合酶和过氧化物酶是一类主要来源于花生四烯酸的C20氧化脂类，在炎症反应中具有特殊作用.前列腺素G/H合酶2(PTGS2)在血管内皮细胞中，将二十二碳五烯酸酯转化为13R-HDPA，13R-HDPA是在细菌感染期间激活巨噬细胞吞噬作用的13系列消退素的前体.巨噬细胞移动抑制因子(MIF)是促炎细胞因子，参与细菌病原体的先天免疫反应，MIF在炎症部位的表达表明其在调节巨噬细胞在宿主防御中的功能中起介体作用，抵消糖皮质激素的抗炎活性.因此，推测白鲜皮的抑菌作用与柠檬苦素同时调控PTGS2和MIF的表达有关，该推测与多篇研究报道之间形成可很好的相互验证.柠檬苦素是白鲜皮中主要特征性物质[5]，Zhao等[13]研究发现柠檬苦素具有抗菌活性.Govindachari等[14]研究发现柠檬苦素对花生柄锈菌具有一定的抑制效果.酪氨酸蛋白磷酸酶非受体2型(PTPN2)通过细胞质激酶JAK1，JAK3及其底物STAT1的去磷酸化来负调节细胞因子(IL2/白介素2和干扰素)介导的信号传导，该信号在细胞因子受体的下游传播，还分别通过STAT3和STAT6的去磷酸化来调节IL6/白介素6和IL4/白介素4细胞因子信号传导.研究表明，IL6是一种细胞因子，由多种类型的具有多效性的细胞产生，抗IL6治疗可减少炎症并具有抗血管生成作用[15].因此，推测白鲜皮的抑菌作用与Calodendrolide和Dictamnusine同时调控PTPN2的表达，进而下调IL6的表达有关.

本研究通过网络药理学的研究方法，分析白鲜皮在抑制细菌方面的有效化学成分和分子机制，通过相关网络图的构建可直观地显示出白鲜皮抑制细菌具有多成分、多途径等共同作用的特点，符合中医药治疗疾病的特点，相比西药靶点单一的作用机制，副作用小，优势明显.