正交试验法优选养心安神颗粒醇提工艺

孙永慧，付玉琪，张 静(黑龙江中医药大学 中医药研究院， 哈尔滨 150040)

养心安神颗粒是由黄芪、白芍、五味子、当归、酸枣仁、川芎等13味中药组成，具有养心安神、益气养血、补肾益智、调和营卫等功效.用于治疗神经衰弱、心悸失眠、倦怠无力、头晕、多梦、耳鸣健忘等症，具有很好的疗效.依据各味药的药效成分将方中五味子、茯神、白茯苓、肉桂、川芎、甘草6味药材采用乙醇提取.其中五味子发挥收敛固涩、益气生津、补肾宁心的作用.木脂素类化合物是五味子的主要有效成分，包括五味子素类、五味子酚类、五味子酯类等，其测定多采用高效液相色谱法[1-9].为保障临床治疗效果，本文探索利用正交试验法优化养心安神颗粒的醇提取工艺，以出膏率及含五味子醇甲的量作为检测的指标，采用高效液相色谱法测定含五味子醇甲的量，作为评价提取工艺的标准.

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Waters2695-2996型高效液相色谱仪(美国Waters公司)；电子天平(奥豪斯仪器有限公司)；HH-6数显恒温水浴锅(江苏省常州普天仪器制造有限公司).

1.2 药材与试剂

五味子、茯神、白茯苓、肉桂、川芎、甘草药材(购买于哈尔滨市道外区人和药材行)；水(超纯水)；乙醇(分析纯)；甲醇(色谱纯)；五味子醇甲(批号：200817-201511，购于中国食品药品检定研究院).

2 方法与结果

2.1 正交试验设计

经过筛选一定因素条件后，最后选定的四个因素分别为：乙醇体积分数(A)、提取次数(B)、提取时间(C)、加乙醇量(D).将上述四个因素定为与提取的效果具有相关性的四个因素[10-13].设计实验的水平为3个水平，以出膏率及含五味子醇甲的量为指标，进行L9(34)正交试验.提取工艺的因素水平表见表1.

表1 乙醇提取工艺因素水平表

2.2 含五味子醇甲量测定

2.2.1 色谱条件

Diamonsil C18色谱柱(5 μm,4.6 mm×250 mm)；甲醇-水(55∶45)为流动相；检测波长为250 nm.柱温30 ℃；流速为1 mL/min；

2.2.2 对照品溶液的制备

精密称量五味子醇甲对照品3.9 mg，放置10 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，混匀，即得五味子醇甲的对照品溶液(0.39 mg/mL).

2.2.3 供试品溶液制备

取五味子7.5 g、白茯苓7.5 g、肉桂5 g、川芎7.5 g、茯神5 g、甘草5 g.依据正交试验表的试验条件提取，得到的溶液浓缩定容至100 mL量瓶中，精密量取10 mL蒸干，加甲醇溶解转移至20 mL的容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液10 mL，即得.

2.2.4 阴性对照试验

取白茯苓7.5 g、肉桂5 g、川芎7.5 g、茯神5 g、甘草5 g.按照正交实验表4号试验条件进行提取，提取液蒸干.处理方法同2.2.3项下供试品溶液的制备.

对照品的色谱图、供试品色谱图、阴性色谱图见图1～3，结果为阴性供试品溶液五味子醇甲的色谱峰位置无干扰.

图1 五味子醇甲对照品溶液HPLC图

图2 样品溶液HPLC图

图3 阴性溶液HPLC图

2.2.5 方法学考察

1)线性关系考察

分别精密吸取对照品溶液2、4、6、8、10、12、15 μL注入色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标，对照品进样微克数为横坐标，绘制标准曲线并计算回归方程.求得回归方程为Y=1.997 6×106X+3.005 2×104(R=0.999 9)，结果表明五味子醇甲于0.78～5.85 μg范围内线性关系良好.

2)精密度试验

精密吸取五味子醇甲对照品溶液，接连进样6次，每次10 μL，峰面积的积分值RSD为1.49%，结果表明本仪器具有良好的精密度.

3)稳定性试验

取供试品溶液，进样10 μL.分别于0、1、2、4、8、12 h重复进样，测定五味子醇甲峰面积.计算其RSD值为1.99%.实验结果表明样品溶液具有比较良好的稳定性.

4)重复性试验

取正交试验表第4号试验提取液制备6份供试品溶液， 各精密吸取供试品溶液10 μL， 进样测定，计算含五味子醇甲的量.计算RSD值为0.94%.实验结果说明，该样品的处理方法符合重现性要求，重复性良好.

5)加样回收率试验

分别精密量取已知含量的供试品提取液5 mL共计6份(1/20量的提取液)，分别加入五味子醇甲对照品，按供试品溶液制备方法制备供试溶液，精密吸取该供试溶液各10 μL，进样测定，计算回收率RSD值为1.21%.所得试验的结果见表2.

表2 加样回收率试验结果

结果表明，本实验确定的含量测定方法合理，具有良好的准确度.

2.3 结 果

依次测定计算正交试验表中每组醇提液的出膏率以及含五味子醇甲的量，综合评分=70%×含五味子醇甲量+30%×出膏率，正交试验结果见表3，方差分析见表4.

表3 醇提取正交试验L9(34)结果表

表4 提取工艺方差分析表

实验结果表明，影响乙醇提取的主次因素顺序为：B>C>A>D.结合K值，按照正交提取的工艺可以得到的最佳提取工艺是：A1B3C3D1，即70%的乙醇溶液，提取次数为3次，提取时间为2 h，加入乙醇的量分别为8倍量、6倍量、4倍量.

2.4 验证试验

根据最佳提取条件，重复进行3次实验，结果与正交试验结果基本一致，表明工艺稳定可行.

3 讨 论

随着新技术、新工艺、新辅料的出现，中药颗粒剂的质量和品类已得到明显特升.颗粒剂是由传统的中药汤剂发展而来的,是中药汤剂的发展与传承，具有生产方便、服用量小、口感好、易贮藏、易携带及运输等优点，满足了对中药现代化、标准化的需求，已经成为人们常用的药物剂型，具有良好的开发和临床应用前景[14-16].

本实验采用不同提取条件测定，综合分析实验结果，最终得到最佳提取条件，对养心安神颗粒的醇提工艺进行了优化，为该复方制剂有效成分提取及今后的研究提供了理论依据.