Egr-1在单眼形觉剥夺性弱视幼猫视皮质中的表达及其意义

范浩博，唐秀平，杨丽源，宋唯琦，王英，陈思宇，邹云春

(川北医学院眼视光学系，四川 南充 637000)

弱视是造成当今世界上儿童视力下降的重要疾病之一[1]，亚洲地区的发病率约1.09%[2]。近年来，随着分子生物学、神经生物学等多学科在弱视致病机制方面的研究深入，目前研究[3-4]证实，弱视治疗的基本依据在于视觉发育敏感期内视觉可塑性的存在，而视觉发育可塑性机制与多种神经递质相关，但具体发病机制尚未完全阐明，还不能在分子水平上详细解释弱视关键期及可塑性发生的变化。突触目前被认为是弱视的最关键环节，其可塑性按时间上可分为长时程增强(long-termpotentiation，LTP)和长时程抑制(long-termdepression，LTD)。而早期生长反应因子-1(early growth responsive gene-1，Egr-1)作为即刻早期基因(Immediate-early genes，IEGs)中Egr家族内的一员，具有编码锌指结构的转录因子的作用。在突触可塑性和记忆的巩固以及LTP的诱导和学习过程中都伴随着Egr-1表达的增加[5]；同时，Egr-1也具有将短时程信号与长时程改变进行偶联的效应，但目前尚未有研究表明Egr-1的表达与弱视的关联。本研究通过观察形觉剥夺性弱视幼猫视皮质Egr-1的表达，探讨Egr-1对视觉发育的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选取3周龄幼猫30只，性别、毛色不限，体重240～350 g，眼底镜检查排除屈光介质混浊及眼底异常；检影验光显示幼猫屈光度为+1.25～+3.25 D。由于幼猫在年龄较小阶段尚无法自主摄取固态食物，故采取人工定时喂养猫奶粉与饮水的方式进行饲养，每日喂食4～5次，保证其健康成长。待其能够自主摄食后，每日早中晚共计3次，检查猫粮与饮水的供应，以保证食物的充沛。饲养房间内温度设定为(24±1)℃，相对湿度保持在50%，房间内各处均能够接受自然光线照射。本研究动物均由川北医学院实验动物中心提供，通过川北医学院实验动物伦理委员会批准并全程接受监督。

1.1.2 实验试剂与仪器 主要试剂：PBS(PH 7.2～7.6)缓冲液(武汉Boster公司，货号：AR0030)、枸橼酸盐(PH 6.0)缓冲液(武汉Boster公司，货号：AR0024)、Egr-1抗体(Bioss公司，货号BS-1076R)、SABC免疫组化染色试剂盒(武汉Boster公司，货号：SA1022)、DAB显色试剂盒(武汉Boster公司，货号：AR1022)、Mayer`苏木素染液(Solarbio公司，货号：G1080)、伊红染色液(Solarbio公司，货号：G1100)。主要仪器：动物电极针(法国罗兰，型号：RL-1223000030-RC-D)、视觉电生理仪(法国罗兰，型号：RETI port/scan 21)、带状检影镜(苏州六六，型号：YZ24B)、病理切片机(Leica，型号：RM2235)、显微成像系统(尼康，型号：DS-Fi2)

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立 随机数字表法将幼猫分为形觉剥夺组与对照组，每组15只。采用1%戊巴比妥钠(35 mg/kg)腹腔注射麻醉两组幼猫。对照组仅做麻醉处理；剥夺组在麻醉后采用“套环遮盖法”[6]进行弱视造模：将3-0线在其右眼眼眶四周对称做四个小套环，用缝线穿过套环连接黑色不透明遮盖布，并于中央制作了一个高约0.7 cm，直径为3 cm的环形遮盖圈，防止光线从侧面透过(图1A)。剥夺组遮盖前与遮盖后的第1、3、5周，对剥夺组幼猫右眼、左眼与对照组右眼行图形视觉诱发电位(pattern visual evoked potential，PVEP)检测。PVEP检测需矫正幼猫屈光不正，检测前将幼猫遮盖布套环上的连接线剪断，取下遮盖布，采用带状检影镜进行检影验光以确定幼猫双眼屈光度(图1B)。PVEP检测时，将三根动物电极针分别依次插入：参考电极(蓝色)置于前额正中皮下，作用电极(红色)置于双耳连线枕部皮肤正中皮下，接地电极(黑色)置于耳尖皮下。调整幼猫头位使其被检测眼视轴与屏幕中央处于同一水平线上(图1C)。PVEP采用棋盘翻转模式进行刺激，距离为50 cm，刺激模式设定为0.3 cpd，视角16.7°，时间频率为1 Hz，对比度97%，采样时间300 ms，叠加64次。并根据此前检影验光结果，选取相应镜片对其屈光不正进行足矫，于暗室条件下进行检测，每只眼重复三次取平均值。检测过程中随时观察并调整幼猫头位使其检测眼视轴与屏幕中央处于同一水平线上。检测后记录剥夺组幼猫右眼、左眼与对照组幼猫右眼的P100波振幅与潜伏期。动物弱视模型建立的成功标准以剥夺组右眼与剥夺组左眼、剥夺组右眼与对照组右眼之间P100波振幅与潜伏期存在统计学时即认为弱视造模成功[7-8]。

1.2.2 取材与切片制作 遮盖后第5周PVEP检查完成后，根据《猫解剖彩色图谱》将所有幼猫进行视皮质与外侧膝状体取材：使用解剖刀从枕外隆突处向前额骨处划开皮肤，剥离颅骨外软组织，使颅骨面暴露(图2A)。使用直剪从枕骨处剪开颅骨，并向前端继续分离两侧颅骨，直至脑组织完全暴露。用组织剪剪断脑部组织与脊髓处的连接，用镊子轻轻提起整个脑组织，从脑组织下方可看见视交叉，剪断视交叉后，即可使整个脑部组织脱离。由背视视角即可见端脑枕回(图2B)；由腹视视角可见端脑梨状叶，分离梨状叶，暴露外侧膝状体(图2C)。随后快速切下端脑枕回与间脑外侧膝状体部，并立即将其放入4 %多聚甲醛固定液(含DEPC)中固定，随后脱水包埋。采用石蜡切片机进行切片，切片厚度设定为4 μm。

1.2.3 HE染色及免疫组化 HE染色：石蜡切片常规脱蜡至水，滴加苏木素染液，1%盐酸酒精分化后，滴加伊红染液，脱水封片。显微镜下观察细胞形态。免疫组化：石蜡切片常规脱蜡至水，3 % H2O2消除内源性过氧化物酶活性，微波热修复抗原，5 % BSA封闭液封闭，滴加一抗，滴加生物素标记山羊抗兔IgG，滴加SABC，DAB显色，苏木素复染细胞核，脱水封片，显微成像系统下进行图像采集分析阳性细胞数与阳性细胞平均光密度。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 PVEP检测

PVEP检测显示，幼猫PVEP主波图像表现为N75-P100-N135复合波，该波具有两个正向波与一个负向波共同构成，呈“M”状(图2.1)。遮盖前，剥夺组右眼、左眼与对照组右眼在P100波潜伏期差异无统计学意义(P>0.05)；遮盖3周后，三组P100波潜伏期与振幅差异有统计学意义(P<0.05)；剥夺组右眼P100波潜伏期高于剥夺组左眼与对照组右眼(P<0.05)；剥夺组右眼振幅低于剥夺组左眼与对照组右眼(P<0.05)；遮盖5周后，剥夺组右眼P100波潜伏期高于剥夺组左眼与对照组右眼(P<0.05)；剥夺组右眼振幅低于剥夺组左眼与对照组右眼(P<0.05)。提示遮盖3周后，剥夺组幼猫右眼已形成单眼形觉剥夺性弱视。见图3、图4、表1及表2。

表1 各组遮盖前后P100波振幅变化

表2 各组遮盖前后P100波潜伏期变化

2.2 HE染色

HE染色显示，遮盖5周后，对照组幼猫视皮层神经元细胞形态以多角形、不规则型居多，细胞间结构紧密；形觉剥夺组视皮层神经元细胞形态多为圆形，少数呈不规则状；局部胶质细胞增生，海绵状变性，部分神经元水肿、变性。见图5。

2.3 免疫组织化学检测

免疫组化检测结果表明，遮盖5周后两组幼猫大脑视皮质中均有Egr-1的阳性信号，即存在Egr-1表达，表达位于细胞胞浆之中，呈棕黄色，细胞核呈蓝色。剥夺组中大部分呈现阳性或弱阳性，阳性细胞数较少；对照组表达强阳性信号较强；剥夺组阳性细胞数与平均光密度均低于对照组(P<0.05)。见表3及图6。

表3 免疫组织化学检测

3 讨论

形觉剥夺性弱视是由于婴幼儿时期，因先天性白内障、上睑下垂、角膜白斑等原因，使光线不能或不正常进入眼内，剥夺了黄斑接受正常光线刺激的机会。其生理性刺激的减少，使处于发育期内的黄斑产生发育不良或停滞[1]。对于幼猫而言，形觉剥夺对其视力的影响一般在出生后至4周龄时达到顶峰，在12周龄后，遮盖产生的形觉剥夺几乎不能够对其视力发育进行干扰[9]。因此，选用3周龄的幼猫通过单眼形觉剥夺的方式建立弱视模型。目前，形觉剥夺性弱视造模的经典方法为上睑缝合法，本小组既往曾采用“套环遮盖法”[10]，即利用黑色遮盖布替代眼睑缝合进行弱视造模。在避免眼睑缝合对眼前节产生损伤的同时，利用剪断连接线实现了对实验动物PVEP变化的连续观察。该方法可以有效阻挡动物遮盖眼各方向的光线进入眼内，并顺利建立弱视动物模型。但造模期间内仍出现个别幼猫头部运动导致遮盖布侧方有光线透过。为改进这一情况，本实验在原遮盖方法上加大了遮盖布的直径，并在遮盖布中央制成具有一定高度的黑色不透明遮盖环，以进一步提升遮盖效能。

本实验PVEP检测采用棋盘翻转刺激，记录到幼猫PVEP主波图像由两个正向波与一个负向波构成，呈“M型”。通过比对同时间不同眼与同眼不同时间P100波振幅与潜伏期，提示改良后的遮盖方法是可行有效的。通过“套环遮盖法”能够成功建立单眼形觉剥夺性弱视动物模型，并能实现对实验动物的眼部生理参数动态检测。

随着近年来弱视研究深入开展，多种参与视觉发育可塑性机制的神经递质，如AMPA受体及其GluR2亚基、NEP1-40、突触素、胆碱能神经元、生长相关蛋白-43、GABA、cPKC-r、NMDAR、NGR-1等[11]都被认为与弱视相关，但仍然不能完全从分子水平上解释弱视关键期与其可塑性变化的关系[3-4]。即刻早期基因作为一类可编码转录因子的原癌基因[12],具有偶联短时程信号与长时程改变的效应，主要包括C-fos、Egr家族以及Arc等,其中有不少转录因子都受到视觉活动的调节。其中，已有充分证据显示C-fos与弱视疾病的关联性。即刻早期基因中Egr家族内的Egr-1[13]，其转录因子在视皮层可塑性变化中是必需的。Egr-1是一种编码锌指结构的转录因子，在突触可塑性和记忆巩固及LTP的诱导和学习过程中，都伴随着Egr-1表达增加[5]。而细胞骨架相关基因Arc作为Egr-1的靶基因之一，是一个突触活性诱导的效应分子，在晚期LTP中具有重要作用。有研究[13]表明，一定条件下，Egr-1可以调控海马CA1区晚期活性依赖性Arc基因转录，即刻早期基因Arc因其具有多能、精细调谐系统，能够连接神经活动的变化模式和突触可塑性，从而优化神经系统信息存储。本实验利用HE染色与免疫组化分别对遮盖5周后的弱视幼猫视皮质与对照组视皮质的组织形态学差异和Egr-1蛋白表达进行了对比与分析。提示在弱视幼猫模型中，视皮层神经元细胞组织形态发生变化，并且伴随局部胶质细胞增生。既往弱视动物模型的研究[14-15]发现弱视动物的神经节细胞、外侧膝状体、视皮质都存在结构方面的变化，并伴随着突触密度下降，这些结构上的变化，又会导致其功能方面进一步改变。本实验研究结果提示在视觉发育关键期内，由于双眼视觉不对等输入，可能会导致视皮质细胞数目及形态发生变化，从而Egr-1蛋白表达下降，而Egr-1蛋白表达下降又进一步对视皮质的正常生理功能产生异常影响，影响视觉发育，从而促进了弱视的发生发展。

视皮层轴突水平的兴奋与抑制的平衡是维持视皮层正常发育和功能的条件，也是影响视觉系统可塑性的重要因素[16]。视神经冲动在脑的第一个突触接替发生在外侧膝状体(LGN)，每侧的LGN接收来自同侧视网膜颞侧半视纤维和来自对侧视网膜鼻侧半视纤维的投射，这种投射具有严格的局部区域对应关系。神经的可塑性主要表现于突触结构和功能的可塑性。弱视发生与突触可塑性改变有关，弱视产生过程中会产生长时程改变，Egr-1和Arc基因与突触长时程改变密切相关。目前多数研究也表明知觉学习可以提高弱视患者的视觉功能[17]，知觉学习是通过反复的视觉刺激，以及具有监督和反馈作用的视觉体验，使视功能得到有效的恢复[18]。研究者发现其机制可能与可塑性相关的兴奋和抑制平衡有关联，而Egr-1和Arc又在人与动物的学习记忆中发挥重要作用[19]。本实验研究进一步证实了在弱视发病过程中，视皮质的Egr-1蛋白表达会产生下降，进一步验证了知觉学习在弱视治疗中的作用。

综上所述，采用套环遮盖法可以实现弱视动物模型的建立和眼球参数的动态测量。基于这一方法所制作的弱视动物模型，发现Egr-1在视皮质的表达明显下降。本实验推测Egr-1在视觉发育过程中起到了重要作用。本研究为进一步探索单眼形觉剥夺是如何调控视皮层神经元，为治疗弱视与深入了解其发病机制提供了新的思路与方向。