陈思言,欧刚,陈斌
(川北医学院附属医院麻醉科,四川 南充 637000)
腹部外伤、失血性休克、严重创伤、感染、烧伤可发生肠缺血-再灌注(ischemia reperfusion injury,IRI)损伤[1]。肠IRI不仅可以引起肠道组织局部损害,还可以导致细菌和毒素移位到体循环,产生异常的组织反应,促炎症细胞因子大量释放入血,引发系统性炎症反应综合征,后期可发展为多器官功能衰竭[2]。因此,目前缺血-再灌注损伤的机制,以及如何减轻IRI产生的炎症反应、氧化应激损伤一直是研究热点。在肠缺血-再灌注损伤中炎症细胞因子发挥了重要作用,在肠道组织发生缺血再灌注后,细胞会释放肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)及IL-6等炎症细胞因子,对受损的细胞组织产生损伤。IL-1和IL-6都具有多种致炎活性,包括白细胞趋化、吞噬细胞刺激、增强下游细胞因子和趋化因子的产生。TNF-α可提高中性粒细胞的吞噬能力,也能促进内皮细胞对IL-1、IL-6的分泌,并能促进中性粒细胞和内皮细胞的黏附作用,从而刺激扩大机体局部炎症反应及组织的损伤[3]。因此,炎性因子在缺血-再灌注过程中的表达水平来反映炎症反应的强烈程度,同时也反映出缺血-再灌注损伤的严重程度。丙泊酚具有麻醉诱导快和恢复迅速的特点,是外科手术麻醉的基本药物。丙泊酚的化学结构与天然抗氧化剂维生素E的结构类似,能抑制氧自由基的产生或拮抗其氧化效应,对缺血-再灌注损伤有预防或治疗作用[4],但丙泊酚对肠缺血-再灌注的炎症反应有何影响,尚未见临床报道。本研究拟构建大鼠肠缺血-再灌注损伤模型,使用丙泊酚预处理,观察对肠组织病理形态学改变,Chiu氏评分[5]及对IL-1、IL-6、TNF-α含量的影响,探讨丙泊酚是否对大鼠肠缺血-再灌注损伤有预防或治疗作用。
健康雄性SPF级SD大鼠40只,体重(220±30)g,购于川北医学院动物实验中心。术前禁食12 h,自由饮水。本研究已通过川北医学院伦理委员会审查,批号为NSMC伦理动物审[2021]01号。
1.2.1 动物模型创建 参考Wang等[6]的实验方法建立肠IRI模型。术前大鼠禁食12 h,自由饮水,给予3%戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔内注射麻醉,待麻醉生效后,将大鼠仰卧位固定于解剖板上,常规手术区域消毒铺巾,取腹正中切口2.0~3.0 cm,用37℃左右无菌生理盐水纱布保护切口,分离肠系膜动脉,以无创微动脉夹夹闭肠系膜动脉(SMA)根部,可见肠系膜动脉搏动消失,结肠组织颜色由鲜红变苍白,表明SMA成功阻断,缝合切口,1h后原切口进腹,移走动脉夹,恢复血流实施再灌注,肉眼可见肠系膜动脉搏动恢复,结肠组织颜色由暗红变为鲜红。术中用白炽灯加热保温,维持直肠温度36~38℃,每隔30 min观察大鼠结肠组织血供情况。
1.2.2 实验分组 采用随机数字表法,将40只大鼠随机分为假手术组(S组)、肠I/R损伤(I/R组)、丙泊酚预处理组(P组)和NS预处理组(NS组),每组各10只。S组和I/R组实验开始前连续3 d腹腔既不注射丙泊酚也不注射生理盐水,实验开始时,S组仅分离肠系膜上动脉而不夹闭,I/R组分离肠系膜上动脉后夹闭1 h,再灌注2 h;P组于实验前每天18∶00点腹腔注射丙泊酚50 mg/kg,连续3 d;实验开始时分离肠系膜上动脉夹闭1 h,再灌注2 h;NS组于实验前同一时间点腹腔注射等容积0.9%生理盐水,实验开始时操作同P组。
1.2.3 标本处理 恢复正常血液灌注2 h时处死大鼠,打开腹腔,迅速取出升结肠组织,用装有4℃生理盐水的注射器冲洗肠道内容物,然后纵向剖开肠道,滤纸吸干水分,切3 mm组织进行组织学分析,把肠道卷成瑞士卷样,然后放入活检盒中维持瑞士卷状浸泡入多聚甲醛,其余部分置于-196℃液氮中保存,检测IL-1、IL-6、TNF-α表达水平。
1.2.4 结肠黏膜形态学观察和病理学分析 实验大鼠结肠组织用多聚甲醛溶液固定24 h,而后经乙醇梯度脱水(70%、80%、90%、95%、100%),二甲苯透明,石蜡包埋,做成蜡块,用石蜡切片机将包埋好的蜡块切成厚度5 μm连续切片,烤片后进行苏木素/伊红染色,显微镜下观察结肠组织病理学改变情况。每个标本取2个不同切片,每个切片取10个视野取均数(100×)。采用Chiu氏评分法[5]评价肠黏膜损伤程度,0分为正常绒毛;1分为绒毛顶端黏膜下出现间隙,毛细血管充血;2分为黏膜下间隙扩大,肠黏膜与黏膜下层分离;3分为黏膜与黏膜下层分离延伸到肠绒毛两侧;4分为绒毛变钝,固有层及其血管暴露,炎性组织浸润;5分为固有层消化崩解,出血或形成溃疡;分值越高表示组织病变越严重。
1.2.5 炎性细胞因子检测 取约100 mg结肠组织,加入0.9 mL生理盐水制成10%的组织匀浆,采用酶联免疫吸附法(ELISA)按试剂盒(江苏酶联生物科技提供)说明书,检测结肠组织中TNF-α,IL-1、IL-6含量。用纯化的抗体包被微孔板,制成固相抗体,向包被抗体的微孔中依次加入抗原、生物素化的抗大鼠抗体、亲和素过氧化物酶复合物(ABC),经过彻底洗涤后用底物TMB显色液显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中炎症因子含量呈正相关。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度值,计算样品浓度。
光镜下:S组肠黏膜绒毛完整光滑,皮下间隙无扩张、无充血、水肿,未见或极少量炎症细胞浸润;I/R组和NS组肠黏膜绒毛排列不规则,黏膜及黏膜下水肿、出血,炎症细胞渗出;P组肠黏膜充血,间质出血较I/R组轻,黏膜缺损、断裂现象较I/R组有明显改善,腺体结构比较清楚。Chiu氏评分结果显示,I/R组和NS组Chiu氏评分高于S组(P<0.05),P组高于S组(P<0.05),但低于I/R组和NS组(P<0.05)。见图1及表1。
表1 各组大鼠结肠Chiu氏评分比较
与S组相比,I/R组和NS组大鼠结肠组织IL-1、IL-6和TNF-α的表达升高(P<0.05);经丙泊酚干预后,P组大鼠结肠组织IL-1、IL-6和TNF-α的表达均下降,且与I/R组和NS组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。
表2 组织炎症因子检测结果比较
本研究通过采用夹闭肠系膜动脉法构建大鼠结肠I/R模型,光镜下可见,I/R组大鼠结肠组织发生明显的I/R损伤(图1),且Chiu氏病理学损伤评分亦高于S组及NS组(P<0.05),与Kalogeris等[7]的研究相符,证实造模成功。本研究发现,丙泊酚干预I/R模型大鼠经丙泊酚干预后的P组大鼠结肠组织肉眼和光镜下显示肠壁外观、黏膜缺损/断裂、间质充血和炎症细胞浸润等病理预处变化较I/R组有明显改善,且Chiu氏评分也低于I/R组(P<0.05),提示丙泊酚理能够有效降低结肠I/R病理损伤。可能的机制[8-14]有:(1)降低炎症因子以及髓过氧化物酶MPO的表达;(2)抑制NADPH氧化酶介导的肥大细胞激活;(3)抑制ROS的过量产生、内质网Ca2+的释放以及线粒体去极化减轻脑缺血再灌注损伤,保护神经系统功能;(4)阻止HIF-Α激活来抑制线粒体功能障碍和氧化应激;(5)BRG-1介导的Nrf/HO-1转录因子的激活,减轻组织羟自由基和超氧阴离子的含量;(7)通过激活Nrf-2通路减轻组织脂质过氧化物丙二醛的积累,提高超氧化物歧化酶(SOD)的活力。
Ayazi等[15]研究指出,IL-1、IL-6、TNF-α为主要的促炎因子,其在血液循环和局部组织中的过度激活可诱发大量炎症介质释放,降低机体免疫功能,引起强烈的全身性和局部性炎症反应。本研究发现,与S组比较,I/R组和NS组结IL-1、IL-6、TNF-α含量升高(P<0.05),故可认为本研究设计的观察指标是合理的。经丙泊酚干预后,P组大鼠结肠组织IL-1、IL-6和TNF-α的含量较I/R组均降低(P<0.05),提示丙泊酚预处理可以通过降低结肠组织IL-1、IL-6和TNF-α含量来减轻大鼠肠缺血再灌注损伤。Idriss等[16]研究也指出,TNF-α是肠缺血再灌注损伤中释放最早、发挥核心作用的一种内源性炎症介质,通过作用于细胞膜上的可溶性受体(TNFR1与TNFR2),激活凋亡蛋白caspase-8诱导细胞凋亡,NF-κB与相应的DNA启动子区域结合可促进促炎细胞因子。由此我们可推测丙泊酚是否是通过阻止NF-κB与相应的DNA启动子区域的结合来抑制促炎因子的释放,这还需要进一步的实验验证。Fatemeh等[17]研究证明5-HT1B/1D受体参与大鼠肠缺血再灌注炎症反应和氧化应激,我们也可以进一步推测丙泊酚是否能够作用于5-HT1B/1D受体。本研究不足之处在于:(1)未研究不同剂量丙泊酚预处理对大鼠结肠缺血再灌注的影响;(2)未证实丙泊酚腹腔注射是否是最佳药物处理方式;(3)未能观察丙泊酚预处理后大鼠的存活率,以更加有利地说明丙泊酚预处理的有效性。丙泊酚对保护肠I/R损伤作用的其他机制,需要进一步的研究与探索。
综上,丙泊酚腹腔注射预处理能够减轻大鼠结肠I/R病理损伤,同时抑制肠I/R的炎症反应。