电针对快速衰老小鼠肝脏自噬及脂质代谢的影响*

杨云昊， 庞 芳， 黄思琴， 杨之雪， 朱正威， 代 攀， 郭 啸， 廖冬梅， 唐成林

(重庆医科大学中医药学院， 重庆 400016)

衰老是机体的一种退化过程，它能引起人体细胞组织的结构和功能受损[1]。这种变化是人类多数疾病的主要致病因素，包括代谢性疾病、神经退行性疾病和癌症等[2]。肝脏是体内脂质代谢的中心器官，在脂类的各种代谢过程中发挥重要作用，其中肝脏脂质过度沉积是衰老的一个重要特征[3]。生理情况下，过度沉积的脂质可被自噬溶酶体降解，即脂噬，它是一种选择性自噬，可以避免肝脏遭受脂质堆积的损害。但是，在病理状态或衰老机体的异常环境中，脂噬会受到抑制，导致脂肪动员减少、脂质沉积，加重肝脂肪变性，而脂噬又会被过多的脂质沉积进一步抑制，形成一种“恶性循环”[4]。因此，脂噬在肝脏脂滴积累相关改变中起着关键作用，其中LC3-Ⅱ、Beclin1、Atg7、P62与脂噬关系最为密切[5]。由此，促进肝脏脂质自噬，调节脂质代谢，对减轻肝脏脂质累积、延缓机体衰老具有重要意义。

本课题组前期研究[6, 7]发现，电针可以通过抑制内质网应激改善其炎症反应治疗非酒精性脂肪肝。因此，本研究采用电针治疗快速衰老小鼠(senescence accelerated mouse/prone8，SAMP8)，检测小鼠肝脂质代谢情况，以及与脂质自噬相关因子的表达变化，来进一步探索电针是否可以通过促进自噬，减轻肝脏脂滴沉积，调节肝脏脂质代谢，从而达到保护肝组织，延缓其衰老的目的。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

21只清洁级30周龄雄性快速衰老小鼠(SAMP8)，7只同源抗快速衰老小鼠(SAMR1)，体质量(30±5)g，购于北京大学医学部实验动物科学部[许可证号：SCXK(京)2016-0010]。SAMP8小鼠按随机数字表法分为模型组、电针组、药物组；以SAMR1小鼠作为对照组，每组均7只。分笼饲养于重庆医科大学动物实验中心IVC(individual ventilated cage)级动物房(动物设施许可证号：SCXK(渝)2018-0003)，12 h明暗交替、恒温恒湿，自由摄取食物和水。实验过程中对动物所有处置完全符合重庆医科大学实验动物伦理规定。

1.2 试剂与仪器

总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)试剂盒：深圳雷杜生命科技有限公司。抗LC3-Ⅱ抗体、抗P62抗体：美国Abcam公司。抗Beclin1抗体：美国NOVUS公司。抗ATG7抗体、抗β-actin抗体：美国CST公司。HRP标记的羊抗兔IgG：武汉博士德生物工程有限公司。Trizol总RNA提取液、SYBRPremixExTaqTMII、RR037A反转录试剂盒LC3-Ⅱ、Beclin1、Atg7、P62、GAPDH引物：日本TAKARA公司。雷帕霉素：美国MCE公司。

0.17 mm×7 mm华龙牌无菌针灸针：北京大名科技有限公司。华佗牌SDZ-Ⅱ型电子针疗仪：苏州医疗用品厂有限公司。低温高速离心机：美国SIGMA公司。T-10匀浆机：德国IKA公司。石蜡切片机：上海徕卡仪器有限公司。MINI蛋白电泳及转印系统：美国Bio-Rad公司。透射电镜：日本日立公司。IX73荧光显微镜：日本Olympus公司。ER-182A型电子天平：德国IKA公司。ThermoND2000超微量核酸蛋白测定仪：上海GENE公司。CFXConnectTM荧光定量PCR检测系统：美国BIORAD公司。T100TMPCR仪、BX53正置显微镜及CellSensStandard图像采集软件：日本Olympus公司。

1.3 干预方法

雷帕霉素是一种免疫抑制剂，可调节与衰老相关的细胞过程。故将该品作为药物对照组进一步检测电针的疗效。将雷帕霉素粉末溶于生理盐水中，浓度4 mg/ml，4℃保存。药物组小鼠给予雷帕霉素腹腔注射(10 mg·kg-1·d-1)，连续给药4周。电针组小鼠固定于泡沫板上，选穴参照《实验针灸学》动物针灸教材[8]，用0.17 mm×7 mm无菌针灸针电针小鼠双侧“肾俞”“太冲”穴，分别连接电针仪正极、负极，连续波，频率2 Hz，电流强度1.0 mA，每次15 min；模型组及对照组的饲养周期与电针组相同，只做小鼠板上固定，不做其他任何处理。每周干预6 d，休息1 d；连续干预4周。上述治疗，均在固定时间由固定操作人员操作。

1.4 取材

干预结束后，禁食禁水12 h，用0.3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，摘眼球取血，37℃水浴静置1 h，3 500 r/min离心10 min，取上层血清于 -80℃冰箱保存。取血完成后将小鼠仰卧固定于手术台上，暴露胸腹部，常规消毒，开腹，取小鼠肝脏组织。每组随机取6只小鼠，取肝左叶于-80℃冰箱保存用于蛋白和RNA检测；肝右叶多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片。

另1只小鼠不做蛋白和RNA检测，灌注1%戊二醛溶液，至小鼠全身硬化，打开腹部取出肝脏。修剪其约1 mm×1 mm×1 mm小方块，放入电镜固定液中于4℃固定。0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗3次，1%锇酸固定液后固定，再漂洗3次。丙酮和酒精4℃梯度脱水，100%丙酮室温脱水，包埋后烘箱内固化，超薄切片机切片，厚70 nm，3%醋酸铀-枸橼酸铅染色，透射电镜观察肝脏自噬小体及自噬溶酶体。

1.5 血生化法检测小鼠血清 TC、TG、LDL水平

取-80℃冰箱中的血清，全自动生化分析仪检测小鼠血清 TC、TG、LDL的含量水平。

1.6 小鼠肝脏组织油红“O”染色观察脂滴沉积情况

取-80℃冰箱中肝脏组织，冰冻切片8 μm厚度，室温晾干后用油红“O”染色10 min，75%乙醇分化2 s，苏木素复染2 min，流水冲洗返蓝，甘油明胶封片。在光学显微镜下观察脂滴沉积情况。

1.7 小鼠肝脏组织免疫荧光染色观察LC3-Ⅱ表达情况

取上述方法制备好的各组石蜡切片进行脱蜡、水化，枸橼酸钠热修复法抗原修复20 min，37℃封闭1 h，LC3-Ⅱ抗体4℃下孵育过夜。次日复温冲洗后，CY3荧光标记羊抗兔IgG(H+L)二抗37℃避光孵育1 h。切片置于PBS中洗涤4次，每次5 min。滴加DAPI染液，室温避光孵育10 min。PBS冲洗后加抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下采图，DAPI紫外激发波长490 nm，发蓝光；LC3-Ⅱ激发波长550 nm，发红光。

1.8 免疫印迹法检测小鼠肝脏组织LC3-Ⅱ、Beclin1、Atg7、P62的蛋白含量

取冰冻保存的肝脏组织样本20 mg，经过称量、裂解、匀浆、离心提取总蛋白；BCA蛋白浓度测定法测得浓度后，加入上样缓冲液制成蛋白样品；SDS-PAGE凝胶电泳后转到PVDF膜上；5%脱脂牛奶室温封闭2 h；加入抗LC3-Ⅱ(1∶1 000)、Beclin1(1∶1 000)、Atg7(1∶1 000)、P62(1∶1 000)、β-actin(1∶5 000)抗体4 ℃过夜；对应二抗室温摇床孵育1 h；滴加ECL化学发光液，暗室曝光1 min，IMAGE STUDIO 成像系统采集图像，Image J分析并计算相对表达量。

1.9 实时荧光定量PCR法检测小鼠肝脏组织LC3-Ⅱ、Beclin1、Atg7、P62的mRNA含量

取冰冻保存的肝脏组织样本20 mg，用Trizol提取总RNA；加入异丙醇、DEPC水，弹匀；超微量核酸蛋白测定仪探头清洗10次，检测总RNA纯度和浓度，按逆转录试剂盒使用说明配制反应体系，放置于 T100TMPCR 仪器中进行反转录反应，条件：37℃15 min，85℃5 s，4℃+∞。按照SYBRGreen法配制反应体系后标板，上机进行qPCR反应，条件：90℃30 s，95℃5 s，60℃30 s，95℃5 s，60℃1 min，40个循环,运用CFXmanager3.1软件读取Ct值，计算平均值。以Folds=2-ΔΔCt表示每组与对照组基因表达的倍比关系。引物序列见表1。

Tab. 1 Primer sequences of RT-PCR

1.10 统计学处理

2 结果

2.1 电针对小鼠肝脏自噬体形态和分布的影响

与对照组相比，模型组肝脏的脂滴密集，而自噬体分布稀疏。与模型组相比，电针组和药物组存在散在脂滴，自噬体分布较为密集(图1)。

Fig. 1 Comparison of the distribution of autophagosomes in liver tissues of mice in different groups(bar=1 μm)

2.2 电针对小鼠血清脂质的影响

与对照组小鼠相比，模型组小鼠的脂代谢相关指标TC、TG、LDL含量显著增高(P<0.01)。经雷帕霉素处理后药物组小鼠的TC、TG、LDL的含量较模型组的得到了明显降低(P<0.01)，在电针组上得到了同样的结果。且电针组与药物组之间的TC、TG、LDL水平无明显差异(P>0.05，表2)。

Tab. 2 Comparison of blood lipids of mice in each group(mmol/L, n=6)

2.3 电针对小鼠肝脏脂滴沉积的影响

与对照组相比，模型组脂滴沉积面积显著增加；与模型组比较，药物组、电针组脂滴的沉积面积减少，其中电针组优于药物组(图2)。

Fig. 2 Comparison of oil red "O" staining of mice in each group(bar=50 μm)

2.4 电针对小鼠肝脏LC3-Ⅱ免疫荧光表达的影响

对照组红色荧光强，分布广泛；模型组荧光强度明显减弱，阳性细胞数量减少；与模型组相比，电针组和药物组的免疫荧光强度明显增强；电针组荧光强度与药物组相当(图3)。

2.5 电针对小鼠肝脏LC3-Ⅱ、Beclin1、Atg7、P62蛋白表达的影响

与对照组比较，模型组LC3-Ⅱ、Beclin1、Atg7蛋白表达量明显降低(P<0.01)，P62蛋白含量明显升高(P<0.01)。与模型组比较，药物组和电针组LC3-Ⅱ、Beclin1、Atg7蛋白表达量明显升高(P< 0.01)，P62蛋白明显降低(P<0.01)。与药物组比较，电针组Beclin1、Atg7蛋白表达量无明显差异(P> 0.05), LC3-Ⅱ、P62的蛋白表达量优于药物组(P< 0.01，图4，表3)。

Fig. 3 Comparison of LC3-Ⅱ immunofluorescence staining of mice in each group(bar=50 μm)

Fig. 4 The expressions of LC3-Ⅱ, Beclin1, Atg7 and P62 in liver of mice in each group detected by Western blot

2.6 电针对小鼠肝脏LC3-Ⅱ、Beclin1、P62、Atg7 mRNA表达的影响

与对照组比较，模型组LC3-Ⅱ、Beclin1、Atg7 mRNA表达量明显降低(P<0.01)，P62 mRNA含量明显升高(P<0.01)。与模型组比较，药物组和电针组LC3-Ⅱ、Beclin1、Atg7mRNA表达量明显升高(P<0.01)，P62mRNA明显降低(P<0.01)。与药物组比较，电针组Beclin1、Atg7、P62mRNA表达量无明显差异(P>0.05，表4)。

3 讨论

人体进入成熟期后，各种组织器官的功能会随着年龄的增长而退化，最显著的变化就是体脂率的增加。肝脏作为重要的代谢器官，在脂肪的储存和代谢中起着关键作用。人体衰老容易造成肝脏脂肪过度堆积，引起脂质代谢紊乱、脂肪性肝炎、肝硬化、代谢综合征以及其他与年龄相关的疾病[9]。中医学认为衰老属于“虚劳”范畴，与五脏六腑关系紧密，尤其是肝脏[10]。《灵枢·天年》曰：“人生十岁，五藏始定……五十岁，肝气始衰，肝叶始薄，胆汁始减，目始不明。”，“五十岁，肝气始衰”是人体由盛至衰的关键点，最先由肝衰，然后心、肺、脾、肾诸脏渐衰，因此有研究提出“人之衰老，肝为先导”的观点[10]。肝肾精血同源，研究表明，肝肾同补的方法治疗虚劳效果明显。“太冲”作为肝经原穴，有通达三焦，激发原气，调动体内正气的作用。“肾俞”作为十二背俞穴之一，具有补肾阳，调肾气的作用。因此，本研究选取“太冲”和“肾俞”两穴来治疗因衰老引起的肝脂代谢紊乱。

Tab. 3 The expressions of LC3-Ⅱ, Beclin1, Atg7 and P62 protein in liver of mice in each group n=6)

Tab. 4 Expressions of LC3-Ⅱ, Beclin1, Atg7, and P62 mRNA in the liver of mice in each n=6)

快速衰老小鼠是研究衰老的优势模型[11]，其特征是在较短的时间内能达到衰老的效果，而衰老引起的肝脏病理变化在该模型上表现的更为突出。Kuhla Angela等[12]发现30周龄SAMP8小鼠有明显的肝功能异常、肝脂肪变性，胆固醇含量增加。因此，SAMP8小鼠是一种可靠的研究肝脏衰老的生理病理的动物模型。本实验结果显示，模型组小鼠血清脂质代谢指标TG、TC、LDL与对照组相比都有显著的上升；油红“O”染色后肝脏脂滴沉积严重，说明衰老小鼠体内脂质代谢发生了异常。而在经过干预以后，电针组和药物组的小鼠脂质代谢指标有明显改善，脂滴沉积显著减少。表明电针可显著调节脂质代谢，减少脂质沉积，且调节作用与药物治疗后水平相当。

为了证实电针在肝脏脂质方面的作用，本研究进一步探索电针的作用机制。当肝脏内脂质储存发生异常，机体会发生一种选择性的自噬形式——脂噬，其过程包括自噬体诱导、自噬体形成以及自噬溶酶体降解这三个阶段。Beclin1是自噬开启阶段不可或缺的基因，具有促进自噬起始囊泡形成的作用，通过与其他自噬因子的拮抗作用参与、诱导自噬[13]。Atg7是自噬上游的关键蛋白，通过激活下游的LC3-Ⅱ和Atg5/Atg12复合物系统，促进自噬体的形成[14]。LC3-Ⅱ与Beclin1都是参与自噬体的形成过程，前者是自噬小体产生的关键蛋白，也是自噬体膜上的标记蛋白。当自噬体形成后，分散于胞浆的LC3-Ⅰ和磷脂酰乙醇胺耦联形成LC3-Ⅱ，分布在自噬体内、外膜上，直至自噬小体与溶酶体融合并将其降解[15]。因此LC3-Ⅱ反映了自噬小体形成的数量，也是自噬延伸阶段的重要标志[16]。而P62作为一种支架蛋白，参与自噬体的降解过程[17]。在自噬晚期阶段，P62与LC3-Ⅱ形成的复合物又作为选择性自噬降解底物在自噬小体內与溶酶体融合后被溶酶体降解。因此，P62反应了溶酶体水解酶的活性，同时也可以作为自噬体降解活性的标志[18]。本次实验结果显示，在衰老小鼠的体内，肝脏Atg7、Beclin-1和LC3-Ⅱ的蛋白及mRNA表达量都有下降的趋势，而P62的蛋白及mRNA表达量相对增高。通过电针治疗以后，肝脏组织中Beclin-1、LC3-Ⅱ和Atg7的蛋白及mRNA表达相应增加，P62的蛋白及mRNA表达下降，表明电针可调控自噬相关因子的表达变化，促进肝内自噬发生，减少肝脏脂质沉积，从而改善肝脏脂质代谢紊乱。

雷帕霉素作为一种临床上广泛使用的免疫抑制剂，它可抑制与细胞衰老相关的受损生物分子的积累，还能调节与衰老相关的病理过程，如自噬、炎症、氧化应激等[19]虽有较好的疗效，但长期服用对人类肝肾具有严重影响，以及葡萄糖耐受不良和免疫抑制[20]。而本研究发现，电针在调节肝脏脂质代谢方面的作用与雷帕霉素相当且无明显毒副作用，但治疗效果的持续性仍需进一步研究。因此，电针在治疗肝脏脂质代谢紊乱方面可作为辅助的治疗手段或者是雷帕霉素药物的优先选择替代物。

综上所述，本研究显示，电针可调节肝脏脂质代谢，减少肝脏脂质沉积，延缓肝脏衰老，其机制可能与电针调控自噬相关分子LC3-Ⅱ、Beclin1、Atg7、P62表达，促进衰老小鼠肝脏自噬发生有密切关系。