GPR81激动剂对非酒精性脂肪肝病大鼠胰岛素抵抗的影响*

张 瑜， 路青华， 曹海芳， 张生荣， 王虎德

(1. 青海省第四人民医院肝病一科， 2. 科教科， 西宁 810000)

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种以肝脏脂类代谢异常，肝细胞内脂肪类物质蓄积过多而呈现弥漫性的肝脂肪变性为主要病理特征的一类临床综合征[1]。目前，NAFLD的发病机制包括胰岛素抵抗、线粒体功能障碍、炎症因子、氧化应激等，其中胰岛素抵抗被认为是NAFLD病理生理基础的中心环节，而炎症细胞因子是影响胰岛素敏感性的重要因素[2]。有研究表明，NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3, NLRP3)炎症小体的形成，可介导IL-1β和IL-18的分泌，从而引起肝脂肪变性和胰岛素抵抗，参与NAFLD的发病过程[3]。

G蛋白偶联受体81(G protein-coupled receptor 81，GPR81)是乳酸受体，其功能异常通常与肥胖、血脂异常、胰岛素抵抗和2型糖尿病密切相关[4]。据报道，GPR81可调节炎症，下调关键的促炎症基因，从而发挥抗炎作用[5]。研究指出GRP81可负性调节NLRP3炎症小体诱导的IL-1β产生，具有抑制炎症激活和器官损伤的作用[6]。然而目前对于GPR81调控NLRP3炎症小体在NAFLD中的作用研究较少，因此本研究通过探讨过表达GPR81对NAFLD大鼠胰岛素抵抗的作用，并初步阐明其作用机制，作为NAFLD新的治疗手段提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、建模及分组

选择清洁级SD雄性大鼠30只，8～12周，体重200～240 g，购自中国科学院昆明动物研究所(合格证号：SCXK(滇)K2016-0001)。将动物随机分为3组，对照组、模型组(NAFLD)、GPR81激动剂组(NAFLD+GPR81激动剂)，每组10只。对照组：基础饲料喂养；NAFLD组：用高脂饮食建立大鼠脂肪肝模型。根据参考文献[7]，NAFLD组给予改良高脂饲料(80%的基础饲料+20%蔗糖)建立脂肪肝模型，造模12周；NAFLD+GPR81激动剂组：自造模开始，每周给予腹腔注射GPR81特异性乳酸激动剂(50 nmol/L)，每周1次，共12周。对照组及NAFLD组每周给予腹腔注射等量生理盐水，每周1次，共12周。造模12周后麻醉处死取大鼠肝脏及外周血。

1.2 实验主要试剂

GPR81激动剂(Sigma公司)；DAB显色试剂盒(碧云天生物科技有限公司)；Trizol(Invitrogen公司)；NLRP3、含CARD结构域的凋亡相关斑点蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1, caspase-1)、胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate 1，IRS-1)、葡萄糖转运蛋白4(glucose transporter 4，GLUT4)、β-actin普通PCR上下游引物(上海生工公司)；NLRP3兔抗鼠单抗(美国Abcam公司)；ASC兔抗鼠单抗、caspase-1兔抗鼠单抗、IRS-1兔抗鼠单抗、GLUT4兔抗鼠单抗、抗羊抗Tyr抗体、抗兔抗Ser抗体、山羊抗兔、兔抗山羊二抗(均购自美国Santa Cruze公司)；大鼠白细胞介素-1β(interleukin 1β，IL-1β)和大鼠白细胞介素-18(interleukin 18，IL-18)ELISA试剂盒(均购自南京建成生物工程研究所)。

1.3 主要仪器

血糖仪(德国罗氏诊断公司)；全自动生化分析仪(日本Olympus)；实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad公司)；Z216MK型冷冻离心机(德国HERMLE公司)；酶标仪(Thermo公司)；石蜡切片机(上海徕卡仪器有限公司)；正置光学显微镜、成像系统(日本尼康)。

1.4 肝生化指标、空腹血糖及胰岛素检测

采用全自动生化分析仪检测甘油三酯(triglyceride，TG)、丙氨酸转氨酶(alanine aminotransfease，ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransfease，AST)；采用血糖仪检测空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)、采用ELISA检测空腹胰岛素(fasting insulin，FINS)，并计算胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)，计算公式[8]：HOMA-IR=FPG×FINS/22.5。

1.5 采用HE染色，光镜下观察各组大鼠肝脏组织病理形态学改变

将肝组织用4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片后苏木精-伊红(HE)染色，光镜下观察肝组织病理学改变。

1.6 采用ELISA法检测各组大鼠肝组织及血清中细胞因子IL-1β和IL-18的表达水平

将肝组织按体重体积比1∶9加入生理盐水在冰浴中充分研磨，制成10%肝匀浆，然后5 000 r/min离心15 min取上清；采集大鼠外周血，2 500 r/min离心15 min取上清；根据ELISA试剂盒说明书操作，使用波长450 nm酶标仪检测光密度，根据标准曲线测出各组大鼠肝匀浆及血清中IL-1β和IL-18的表达水平。

1.7 采用Western blot检测肝组织中NLRP3、ASC、caspase-1、IRS-1、Tyr465-IRS-1、Ser636-IRS-1、GLUT4的蛋白表达

取肝组织加入RIPA 裂解液裂解后提取肝组织中总蛋白，每组按40 μg蛋白上样量经10% SDS-PAGE凝胶进行电泳分离，电转移至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭 1 h；分别加入一抗(1∶500稀释)，孵育12 h；加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶1 000稀释)，室温孵育1 h，加入ECL化学发光法检测，以β-actin为内参，应用Quantity One软件成像及定量分析。

1.8 采用qRT-PCR法检测肝组织NLRP3、ASC、caspase-1、IRS-1、GLUT4 mRNA表达水平

Trizol法提取肝组织总RNA，逆转录获得cDNA，采用SYBR Green I实时荧光定量PCR方法检测各组肝组织NLRP3、ASC、caspase-1、IRS-1、GLUT4基因的表达水平。引物由上海生工公司设计合成，引物设计见表1。反应条件：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共40个循环，最后72℃延伸5 min。每个样本重复检测3次。以β-actin为内参，每组基因的相对表达量按公式(2-△△Ct法)计算。

Tab. 1 Primer sequences for amplification of various genes by PCR

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠肝生化指标、空腹血糖及胰岛素的比较

与对照组相比，NAFLD组大鼠血清肝生化指标TG、ALT、AST、FPG、FINS和HOMA-IR值均显著升高(P<0.05)；与NAFLD组相比，GPR81激动剂组大鼠血清TG、ALT、AST、FPG、FINS和HOMA-IR值均显著降低(P<0.05，表2)。

2.2 各组大鼠肝脏组织病理形态学的比较

光镜结果显示，对照组大鼠肝脏形态正常，肝细胞结构清晰，排列正常，细胞中央有大而圆的细胞核，细胞质均匀；NAFLD组大鼠肝细胞体积增大，排列不规则，可见明显的肝细胞脂肪变性，肝细胞有脂肪滴，存在明显的炎性细胞浸润；GPR81激动剂组大鼠肝细胞脂肪变性较NAFLD组明显减轻，脂肪滴及炎性细胞浸润明显减少(图1)。

Tab. 2 Liver biochemical indexes, fasting blood glucose and insulin in each group n=10)

Fig. 1 Histopathology of liver in each group (HE ×200)

2.3 各组大鼠肝组织中NLRP3信号通路相关基因的蛋白表达的比较

NAFLD组肝组织中NLRP3、ASC、caspase-1、Ser636-IRS-1的蛋白表达与对照组相比显著升高，而IRS-1、Tyr465-IRS-1、GLUT4的蛋白表达显著降低(P<0.05)；与NAFLD组相比，GPR81激动剂组大鼠肝组织NLRP3、ASC、caspase-1、Ser636-IRS-1的蛋白表达水平显著降低而IRS-1、Tyr465-IRS-1、GLUT4的蛋白表达显著升高(P<0.05，图2，表3)。

Fig. 2 Protein expressions of NLRP3, ASC, caspase-1, IRS-1, p-IRS-1 and GLUT4 in liver tissue

2.4 各组大鼠肝组织NLRP3、ASC、caspase-1、IRS-1、GLUT4 mRNA表达水平的比较

与对照组相比，NAFLD组肝组织NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA表达水平显著升高，而IRS-1、GLUT4 mRNA表达水平显著降低(P<0.05)；与NAFLD组相比，GPR81激动剂组大鼠肝组织NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA表达水平降低而IRS-1、GLUT4 mRNA表达水平显著升高(P<0.05，表4)。

2.5 各组大鼠肝组织及血清细胞因子IL-1β和IL-18含量的比较

与对照组相比，NAFLD组和GPR81激动剂组大鼠肝组织及血清中IL-1β和IL-18的含量均显著升高(P<0.05)；与NAFLD组相比，GPR81激动剂组大鼠肝组织及血清中IL-1β和IL-18的含量显著降低(P<0.05，表5)。

3 讨论

NAFLD往往与代谢性疾病并存，如肥胖、2型糖尿病、高脂血症、代谢综合征等。胰岛素抵抗参与NAFLD发病的理论已被公认，它对血糖稳态、细胞合成代谢和器官葡萄糖摄取产生影响[9]。胰岛素抵抗可导致脂肪肝发生，而脂肪肝又可加重胰岛素抵抗[10]。有研究表明，NAFLD模型组小鼠血清空腹血糖、胰岛素、胰岛素抵抗指数、ALT和AST均明显高于对照组，且胰岛素抵抗在NAFLD发病中起重要作用[11]。本研究用高脂饮食建立非酒精性脂肪肝大鼠胰岛素模型，结果表明与对照组相比，NAFLD组大鼠血清肝生化指标TG、ALT和AST及FPG、FINS和HOMA-IR值均显著升高；病理结果表明NAFLD组大鼠肝细胞体积增大，排列不规则，可见明显的肝细胞脂肪变性，肝细胞有脂肪滴，存在明显的炎性细胞浸润，提示NAFLD组大鼠在脂肪变性的过程中发生了胰岛素抵抗，NAFLD大鼠模型建立成功。

Tab. 3 The expression levels of NLRP3 signaling pathway related proteins in liver tissues in each group n=3)

Tab. 4 The mRNA expression levels of NLRP3 signaling pathway related genes in liver tissues in each group n=10)

Tab. 5 The contents of IL-1β and IL-18 in liver tissue and serum of rats in each group n=10)

代谢性炎症在非酒精性脂肪性肝炎的发生发展中起重要作用，NLRP3的激活促进IL-1β和IL-18的分泌与非酒精性脂肪性肝炎密切相关，而NLRP3炎症小体的激活又与高脂饮食脂肪酸的大量摄入有关[12]。IRS-1是胰岛素底物受体，在介导胰岛素作用方面起着重要作用。除了通过基因表达调节外，IRS-1的活性主要由其磷酸化调节[13]。在病理状态下，炎症通路被激活，释放炎症因子并通过抑制胰岛素通路蛋白表达和信号传递影响对葡萄糖的吸收、IRS-1蛋白表达减少，导致胰岛素敏感性降低[14]。有研究报道，IRS-1酪氨酸磷酸化使胰岛素下游信号通路激活，胰岛素发挥作用；丝氨酸磷酸化抑制胰岛素下游信号引起胰岛素抵抗；而炎症细胞因子、缺氧和内质网应激可通过抑制IRS-1和IRS-2丝氨酸的磷酸化直接抑制胰岛素作用[15]。GLUT4是一种重要的跨膜转运蛋白，能促进机体对葡萄糖的吸收，GLUT4表达下降可诱导发生胰岛素抵抗。有研究表明，抑制NLRP3炎症小体的激活及炎症因子的产生，降低p-IRS-1的表达，促进IRS-1和GLUT4的表达，从而改善高脂饮食小鼠肝脏和骨骼肌的胰岛素抵抗[16]。本研究结果表明，与对照组相比，NAFLD组肝组织NLRP3、ASC、caspase-1的表达水平及Ser636-IRS-1的蛋白表达水平均显著升高，且肝组织及血清中IL-1β和IL-18的含量升高；而IRS-1、Tyr465-IRS-1、GLUT4的表达水平显著降低；结果提示NAFLD组大鼠肝脏炎性水平显著升高，NAFLD大鼠发生胰岛素抵抗。

GPR81是乳酸的特异性受体，具有调节脂肪细胞发育和分化、抑制脂肪分解、抑制炎性反应等生物学功能[17]。GPR81激动剂能抑制啮齿动物的空腹血浆游离脂肪酸水平，并降低胰岛素抵抗和糖尿病小鼠模型的胰岛素敏感性[18]。有研究表明，GPR81激活可以通过降低氧化应激和细胞因子表达，对动脉粥样硬化起到保护作用[19]。本研究结果表明，GPR81激动剂组大鼠血清肝生化指标较NAFLD组均显著降低；光镜结果显示，GPR81激动剂组大鼠肝脂肪变较NAFLD组明显减轻，脂肪滴及炎性细胞浸润明显减少；与NAFLD组相比，GPR81激动剂组大鼠肝组织及血清中IL-1β和IL-18的含量降低，且肝组织NLRP3信号通路相关基因表达水平改善；上述结果提示，GPR81激动剂可抑制细胞因子的释放，降低IRS-1的磷酸化水平，促进IRS-1和GLUT4的表达水平，从而改善NAFLD大鼠胰岛素抵抗和肝脂肪变，可能与GPR81激动剂抑制NLRP3信号通路有关。

综上所述，高脂饮食诱导的NAFLD中，NLRP3信号通路参与NAFLD胰岛素抵抗，GPR81激动剂可抑制NLRP3信号通路的激活，还可以改善炎症反应引起的NAFLD胰岛素抵抗，对NAFLD具有保护作用，表明NLRP3信号通路活化介导炎症因子产生促进了NAFLD的发生发展。