高效液相色谱-串联质谱法检测鸡蛋中的氟喹诺酮类药物残留

穆小婷 宋 佳 胡克科 别又才 陈智标

1（清远市农业科技推广服务中心，广东清远 511500）

2（清远市农产品质量检验检测中心，广东清远 511500）

氟喹诺酮类（FQs）抗生素是人工合成的新型杀菌广谱型抗菌药物，通过抑制细菌DNA 螺旋酶，阻断DNA 复制而产生抗菌作用，对G+、G-、支原体、衣原体均有很好的杀菌作用，因其高效、低毒、价格低廉等特点而被广泛用于动物和水产养殖中，尤其多应用于治疗家禽的感染性疾病。但过量使用氟喹诺酮类抗生素不仅会使生物体产生耐药性，药物残留于畜禽体内，而且，被食用后会累积在人体中，对成人体内各大系统及中枢神经造成不同程度的损伤，长时间食用甚至会致癌、致畸。为了有效地对动物源性食品中氟喹诺酮类药物残留进行检测和监控，国内外建立了多种氟喹诺酮类药物残留的检测方法，常用的检测方法有高效液相色谱法和液相色谱-质谱法，在颁布的相关标准中，农业部781 号公告-6-2006《鸡蛋中氟喹诺酮类药物残留量的测定高效液相色谱法》能够用于检测鸡蛋中氟喹诺酮类药物残留量，但缺点是回收率太低，无法满足当前要求；GB/T 21312—2007《动物源性食品中14 种喹诺酮药物残留检测方法液相色谱-质谱/质谱法》可同时检测鸡肉和鸡蛋中的喹诺酮药物残留，但在实际操作中提取效果并不理想，达不到检测分析所需要求。

本文在GB/T 21312—2007《动物源性食品中14 种喹诺酮药物残留检测方法液相色谱-质谱/质谱法》 的基础上，对标准中的提取步骤进行了优化，并试验了常用的8 种喹诺酮类药物的检测效果，以期为鸡蛋中氟喹诺酮类残留的测定提供参考。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

柠檬酸、碳酸氢二钠、乙二胺四乙酸二钠、盐酸、氢氧化钠、乙酸铵，均为分析纯；甲醇、乙腈，均为色谱纯；甲酸，优级纯。

HLB 固相萃取柱、电子天平（120 g/0.1mg）、漩涡混合器、高速离心机、超纯水机、超声波清洗器、固相萃取装置。

1.2 仪器条件

离子源：电喷雾离子源（正离子扫描模式）；扫描方式：多反应监测模式；雾化气：氮气；碰撞气：氩气；毛细管电压：0.35 kv；源温度：150 ℃；脱溶剂气温度：350 ℃；脱溶剂气流：1 000 L/Hr；锥孔气流：30 L/Hr，驻留时间：0.028 s。其他参数如表1 所示。

表1 8 种待测物及3 种内标物的监测离子对参数

1.3 样品前处理步骤

1.3.1 提取

称取均质试样5.00 g，置于50 mL 聚丙烯离心管中，加入40 mL 0.1 moL/L EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液，1 000 r/min 漩涡混合1 min，超声提取10 min，-18 ℃冷冻30 min，12 000 r/min 离心10 min（4 ℃），取上清液到另一50 mL 离心管，用0.1 mol/LEDTA-Mcllvaine 缓冲溶液定容到50 mL。吸取20 mL已定容好的提取液到另一50 mL 离心管，加入20 mL正己烷，振荡1 min，12 000 r/min 离心10 min，取下层提取液到50 mL 离心管。

1.3.2 净化

先用6 mL 甲醇洗涤、6 mL 水活化HLB 固相萃取柱，后将提取液以2 mL/min～3 mL/min 的速度过柱。弃去滤液，用2 mL 5%甲醇水溶液淋洗，弃去淋洗液。将小柱抽干，再用6 mL 甲醇洗脱并收集洗脱液。洗脱液用氮气吹干，1 mL 0.2%甲酸水溶液溶解，1 000 r/min 漩涡混合1 min，过孔径0.22 um滤膜，供高效液相色谱质谱联用仪测定。

2 结果分析及讨论

2.1 方法的优化

2.1.1 提取液pH 的优化

按GB/T 21312—2007 步骤用pH4.0 的Mcllvaine缓冲溶液进行提取时发现，鸡肉和鸡蛋的提取效果非常差，尤其鸡蛋，提取离心后几乎没有分层，很难进行下一步试验。根据氟喹诺酮类的化学结构可知，多数氟喹诺酮类在C-3 处含有羧基，C-7 处连有哌嗪等含氮碱性基团，属于酸碱两性化合物，其酸解离常数pKa=5.5～6.6，碱解离常数pKa=7.2～8.9，等电点pKI≈7。鉴于此，本试验将Mcllvaine 缓冲溶液的pH 调节为7.0，试验结果显示，提取后出现明显的分层，因此本试验将Mcllvaine 缓冲溶液的pH 调节为7.0。

2.1.2 添加正己烷除脂

GB/T 21312—2007 中离心结束后直接取上清液过柱，可实际试验发现，因离心时分层效果并不理想，尤其鸡蛋的油脂含量高，很难取到上清液，虽然经过提取液pH 的改良，分层效果好很多，但除脂效果还是不理想。因此，考虑加入正己烷除脂。试验采用上清液和正己烷1∶1 除脂，分取20 mL上清液，结果发现离心后上清液很清澈，回收率也良好，与杨嘉伟试验结果有所不同，而与杨朝琳的试验结果相统一。考虑到分取体积太少增大误差，本试验最终确定分取体积20 mL，加入正己烷20 mL 进行除脂。

2.1.3 鸡肉鸡蛋合并提取

GB/T 21312—2007 中鸡肉和鸡蛋的提取液是同一种，但提取次数及提取液体积不同。鸡肉提取步骤为加入20 mL 0.1 moL/L EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液，提取3 次，合并上清液。鸡蛋提取步骤为加入40 mL 0.1 moL/L EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液提取1 次。在实际试验过程中，大部分情况都是批量试验，且鸡肉鸡蛋同一批次做，因此，本试验研究如何将二者的提取步骤统一。经反复试验发现，鸡肉鸡蛋均加入 40 mL 0.1 moL/L EDTA-Mcllvaine 缓冲液提取，提取后将提取液转入另一离心管后用0.1 moL/L EDTA-Mcllvaine 缓冲液定容至50 mL，这样提取其结果回收率并不低于原步骤，且比原步骤简单易操作。

本试验在离心前增加冷冻处理30 min 的步骤。因少部分样品脂肪含量太高，经过前面的优化还是不能很好的分层，因此本试验对冷冻处理和热处理进行对比，即将样品放在冰箱中冷冻30 min，或在水浴锅中进行热沉淀，之后再进行离心提取，结果发现，分层效果不好的样品经过冷冻30 min 处理即可得到解决。在实际操作中，若经过前面处理步骤可以得到很好的上清液则不需要进行此步骤。另外，试验采用性质相似的同位素内标法进行测量，有效降低了前处理过程中的操作误差和其他条件导致的不统一及基质效应对结果的影响。图1～图11为鸡蛋中待测物及内标物的定性定量离子色谱图。

图1 氧氟沙星定性定量离子色谱图

图2 洛美沙星定性定量离子色谱图

图3 培氟沙星定性定量离子色谱图

图4 诺氟沙星定性定量离子色谱图

图5 恩诺沙星定性定量离子色谱图

图6 环丙沙星定性定量离子色谱图

图7 达氟沙星定性定量离子色谱图

图8 沙拉沙星定性定量离子色谱图

图9 恩诺沙星-D5 离子色谱图

图10 环丙沙星-D8 离子色谱图

图11 诺氟沙星-D5 离子色谱图

2.2 方法学论证

2.2.1 校准曲线和线性范围

将混合标准工作液用初始流动相（甲醇-乙腈溶液：0.2%甲酸水溶液=1∶9）逐级稀释成5.0 ng/mL～100.0 ng/mL 的标准系列溶液。平行称取鸡蛋阴性样品5.00 g，分别置于6 支50 mL 聚丙烯离心管中，加入标准系列溶液1.0 mL，最终形成5.0 ng/mL（1.0 μg/kg）、10.0 ng/mL（2.0 μg/kg）、25.0 ng/mL（5.0 μg/kg）、50.0 ng/mL（10.0 μg/kg）、75.0 ng/mL（15.0 μg/kg）、100.0 ng/mL（20.0 μg/kg）6 个标准系列溶液，按以上优化后的步骤进行提取和净化。以所得的8 种氟喹诺酮类药物的离子峰面积为纵坐标，标准溶液的质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。表2 为回归方程和相关系数。

2.2.2 检出限和定量限

鸡蛋中氧氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、达氟沙星、沙拉沙星8 种检测指标在GB/T 21312—2007 中检出限分别为0.5 μg/kg、0.5 μg/kg、1.0 μg/kg、1.0 μg/kg、0.5 μg/kg、1.2 μg/kg、0.5 μg/kg、1.0 μg/kg，定量限分别为2 μg/kg、2 μg/kg、3 μg/kg、3 μg/kg、2 μg/kg、4 μg/kg、2 μg/kg、3 μg/kg。本试验以标准曲线上的最低点，取信噪比为S/N=3，结合稀释倍数计算得出检出限；以标准曲线上的最低点，取信噪比为S/N=10，结合稀释倍数计算得出定量限，试验结果如表2 所示。8 种氟喹诺酮类药物的方法检出限在0.001 μg/kg～0.009μg/kg 范围内，定量限在0.003 μg/kg～0.031 μg/kg范围内，均达到了国家标准相关要求。

2.2.3 准确度和精密度

称取5.00 g 阴性鸡蛋样品，以GB/T 21312—2007 中方法测定低限为基础，以GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》附录F中检测方法确认的技术要求为试验依据，在方法测定低限（1.0 μg/kg）、2 倍方法测定低限（2.0 μg/kg）、10 倍方法测定低限（10.0 μg/kg）进行三水平试验，按本文优化后的方法进行前处理。8 种氟喹诺酮类药物的平均回收率为81.60%～103.88%，相对标准偏差为0.78%～9.91%，方法的准确度和精密度均可达到国家标准相关指标要求，具体结果见表2。

表2 鸡蛋中8 种待测物线性方程、相关系数、检出限、定量限、回收率及精密度(n=6)

3 结论

本试验对GB/T 21312—2007《动物源性食品中14 种喹诺酮药物残留检测方法液相色谱-质谱/质谱法》中部分步骤进行优化，结果表明，优化后的方法灵敏度更高，重现性更好，能够满足鸡蛋中氟喹诺酮类药物残留的例行检测。另外，因篇幅有限，文章只提供了针对鸡蛋中氟喹诺酮类药物残留检测相关数据，事实上，此方法针对鸡肉中的8 种氟喹诺酮类残留量检测同样适用，且回收率和灵敏度均可达到国家标准要求。文章旨在为防范非法添加氟喹诺酮类药物残留提供技术依据。