HLA-G 在口腔黏膜白斑中表达的临床意义探讨

吴平凡，郭凌燕，陈林林，陈蔚华（通讯作者）

（南昌大学附属口腔医院<江西省口腔生物医学重点实验室>口腔颌面外科 江西 南昌 330006）

人类白细胞抗原-G（human leukocyte antigen,HLA-G）属 于 非 经 典HLA- Ⅰb 类 分 子，1987 年 由Geraghty 首次克隆成功[1]。其最早被发现表达在母-胎界面的绒毛外滋养层细胞，防止母体排斥胎儿，是构成母胎免疫耐受的重要机制之一。有研究表明[2]，HLA-G表达的上调可能是肿瘤逃避免疫监视的原因之一。口腔黏膜白斑（oral leukoplakia, OLK）被认为是最常见的口腔癌前病损，有关口腔黏膜白斑中HLA-G 抗原表达情况的研究较少。本研究采用免疫组化技术了解HLA-G 抗原在OLK 中的表达情况，并探讨其与白斑病理分级之间的关系。

1.资料与方法

1.1 资料

鼠抗人HLA-G 单克隆抗体（abcam 公司）。通用型SP 试剂盒（北京中杉金桥公司），DAB 显色剂。

收集2018 年1 月—2019 年12 月于南昌大学附属口腔医院手术切除并经病理证实为口腔黏膜白斑病例58 例，其中单纯性增生12 例，轻度异常增生15 例，中度异常增生13 例，重度异常增生18 例。正常口腔黏膜标本25 例。OSCC 标本31 例。纳入标准：（1）术前口腔黏膜白斑患者未行局部药物注射治疗；（2）术前口腔鳞癌患者未行放化疗；（3）手术病理切片保存完整，诊断均由经验丰富病理科医师诊断明确。排除标准：排除口腔黏膜白斑局部癌变患者。

1.2 方法

免疫组化采取SP 法对组织切片进行染色。每个标本行4 μm 厚连续组织切片，常规行HE 染色，用0.1 g/L磷酸盐缓冲盐溶液代替1 抗作为阴性对照。预实验确定HLA-G 抗体最佳工作浓度为1:100。

结果观察在10×40 倍光学显微镜下观察组织切片的显色反应，对每张切片选取5 个不同视野，以细胞膜、细胞质或细胞核呈现棕黄色反应判为阳性表达，由两位病理学专家在光镜下判读结果，阳性细胞表达率M=（阳性细胞数/记数细胞总数）×100%，25%记为-，25%M50%记为+，50%M75%记为++，M75%记为+++。统计时“-”归为阴性表达，其他皆为阳性表达，且“+”为弱阳性表达“++”、“+++”均归为强阳性表达。

1.3 统计学分析

采用SPSS 23.0 统计软件处理数据。各组HLA-G免疫组化结果与临床病理参数的关系采用χ2检验。P＜0.05 为有显著差异。

2.结果

2.1 正常口腔黏膜上皮及口腔鳞癌HLA-G 的表达

HLA-G 在正常口腔黏膜标本中未见表达。31 例口腔鳞癌标本中有21 例(67.74%) 出现了阳性表达，以强阳性表达为主(19/21)，阳性信号可见于细胞膜、细胞核或细胞质中，与正常口腔黏膜组比较有显著差异(χ2=27.10，P=0.001)，与正常组比较，增生患者表达也有显著差异（P＜0.05）。(见图1、表1)。

表1 正常口腔黏膜、口腔黏膜白斑、口腔鳞癌中HLA-G 表达免疫组化结果

图1 在正常口腔黏膜及口腔鳞癌中的表达（SP×100）

2.2 各病变组口腔黏膜HLA-G 的表达情况及与临床病理参数之间的关系

HLA-G 抗原在OLK 中阳性表达率为31.03%（18/58），主要定位于上皮基底层细胞、棘层细胞的胞膜、细胞质或胞核上，呈浅黄或棕黄色着色（见图2），与正常口腔黏膜组相比具有统计学差异（χ2=9.91，P＜0.05）。随着异常增生程度的增加，其HLA-G 抗原的表达逐渐增高，以弱阳性表达为主，上皮固有层内可见有大量淋巴细胞浸润。虽然在单纯性增生、轻度异常增生及中度异常增生的OLK 组中HLA-G 均见有表达，但其组间比较未见统计学差异（χ2=0.8，P＞0.05）。

图2 HLA-G 在各级OLK 中的表达

重度异常增生的OLK 中HLA-G 抗原的表达显著性的高于单纯性增生的OLK 组（χ2=7.47，P＜0.01），且以强阳性表达为主。伴有重度异常增生的OLK 中HLA-G抗原的表达和口腔鳞癌未见统计学差异（χ2=0.03，P＞0.05）。

3.讨论

口腔黏膜白斑的形成除局部不良长期刺激以外，也与机体免疫功能密切相关，其中最重要的是细胞免疫。免疫细胞监控失调是恶性肿瘤产生的必要条件，肿瘤细胞可通过低表达MHC 及共刺激分子，上调抑制性分子等机制抑制免疫细胞的功能，从而躲避人体免疫系统的攻击。HLA-G 是Paul 等[3]首次在肿瘤细胞中发现，自被发现以来，HLA-G 逐渐进入肿瘤研究者的视线。HLA-G 在多种恶性肿瘤组织中表达程度与肿瘤分化水平、患者生存预后紧密相关[4]。口腔黏膜癌前病变中白斑较常见，有关其HLA-G 的表达是否异常增高的研究尚未见报道。

在本研究[5]中笔者发现在单纯性增生、伴有轻度异常增生及中度异常增生的OLK 中随着异常增生程度的增加，虽然其HLA-G 抗原的表达逐渐增高，但均以弱阳性表达为主，且固有层内可见有大量淋巴细胞浸润。这些提示笔者OLK 在发生初期局部免疫系统并未因抑制性分子HLA-G 完全破坏，相反黏膜下固有层内出现大量淋巴细胞反应性增生，这些非特异性免疫细胞使得局部免疫能力可能出现反应性增强，后期随着病变发展又逐渐减弱。口腔鳞癌HLA-G 抗原的表达显著高于正常口腔黏膜组，与以往的研究相符。伴有重度异常增生的口腔黏膜白斑中HLA-G 抗原的表达显著性的高于其他OLK 组，且以强阳性表达为主。笔者认为可能在白斑发展的后期，局部微环境可能存在刺激HLA-G 产生的各种细胞因子，如IL-1β, IL-10，IFN-γ，及TGF-β 等。

本实验从蛋白表达水平检测了HLA-G 抗原在口腔黏膜白斑中存在有表达增高的现象，尤其在伴有重度异常增生时，其增高与异常增生的水平有关。笔者先前研究已证实MHC-I 类抗原于口腔黏膜白斑中存在一定程度的表达降低。由此可见口腔黏膜白斑的产生是选择了MHC-I表达阴性克隆的结果，同时HLA-G 的异常表达使得不仅逃避了特异性细胞毒性T 淋巴细胞的监视，而且抑制NK细胞的防御机制，共同营造了一个免疫抑制微环境，使得白斑逐渐向癌变方向发展。