芪莲益髓清毒颗粒对低危骨髓增生异常综合征的疗效及其对TET2和IDH1基因的作用*

王 琰， 李亭亭， 沈明月， 王振振， 郑 伟， 崔思远， 徐瑞荣△

（1山东中医药大学附属医院，山东省卫健委中西医结合血液学重点实验室，山东济南 250014；2博兴县中医医院，山东滨州 256500；3山西医科大学药学院，山西太原 030001）

骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS）是一种较为常见的恶性克隆性血液病，一系或多系外周血细胞减少为其常见临床特征，且伴有髓系细胞的发育异常，具有高度向急性髓系白血病（acute myelogenous leukemia，AML）转化的风险［1］。MDS 多发于中老年人，目前，支持治疗、促造血治疗、免疫调节、去甲基化药物及造血干细胞移植等是MDS 常用的西医治疗方法，但长期应用会出现一系列毒副反应，如肝肾功损害和骨髓抑制等。由于危险度分层的不同，MDS 患者的预后也存在较大的个体差异，中医中药在MDS 的治疗中显现出其特有的增效减毒的优势。

研究表明，MDS发病机制多样化，而表观遗传学的DNA 甲基化是其重要的发生发展机制之一，这与抑癌基因的表达密切相关，大部分MDS 患者都存在DNA 甲基化。DNA 的高度甲基化导致抑癌基因表达沉默，经去甲基化治疗后，可重新激活其表达，从而起到抵御疾病的作用。目前，去甲基化药物是临床上治疗MDS的一种有效方法，取得了一定的疗效。甲基胞嘧啶双加氧酶2（methylcytosine dioxygenase 2，TET2）和异柠檬酸脱氢酶1（isocitrate dehydrogenase 1，IDH1）是MDS 中较为常见的抑癌基因，主要涉及的机制是DNA 甲基化的代谢控制。近年来，中药有效组分对于恶性肿瘤的治疗作用研究较为深入，如半枝莲和白花蛇舌草等，中医中药在抑制肿瘤细胞进展，改善患者症状体征方面都取得了很好疗效。芪莲益髓清毒颗粒是我院血液科根据我们临床应用近40 年的益气养阴方化裁而来，具有益气养阴、补骨生髓和清热解毒的功效。芪莲益髓清毒颗粒治疗MDS 疗效显著，部分机制可能与抑癌基因DNA去甲基化有关。

本研究我们观察了芪莲益髓清毒颗粒对IPSS-R低危MDS 患者临床疗效的影响，并对其安全性进行评估，通过检测患者治疗前后骨髓中TET2和IDH1mRNA 的表达和DNA 甲基化以探寻其作用机制，基于液相色谱质谱（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）联用技术筛选芪莲益髓清毒颗粒中甲基化相关化学成分，为其临床应用提供参考资料。

材 料 和 方 法

1 临床资料的收集

1.1 诊断标准 西医MDS 诊断标准：参考《骨髓增生异常综合征诊断与治疗中国专家共识（2014 年版）》［1］，临床分型标准参照WHO 2016年修订的临床分型标准，预后评分参考IPSS-R国际预后积分系统。中医诊断标准：参照《中药新药临床研究指导原则（试行）》［2］，并结合临床经验，辨证属脾肾两虚、毒淤阻滞证，症见头晕、乏力、心悸、唇甲苍白、盗汗、腰膝酸软、发热、口渴、便溏、夜尿多。

1.2 纳入标准 （1）年龄18～70 岁；（2）符合MDS诊断标准及临床分型标准；（3）符合MDS中医诊断标准，辨证属脾肾两虚、毒瘀阻滞证的患者；（4）本研究纳入患者均为低危（包括极低危）患者，骨髓原始细胞均＜5%，IPSS-R 评分≤3 分；（5）自愿参加本项目研究，并签署知情同意书者。

1.3 排除及剔除标准 （1）精神疾病患者；（2）接受去甲基化治疗患者；（3）孕期及哺乳期妇女；（4）合并其他恶性肿瘤或血液病者；（5）合并严重出血、感染、心肝肾功能不全者。

1.4 一般资料 选取2018 年01 月～2019 年10 月就诊于山东中医药大学附属医院血液病科的IPSS-R低危MDS 患者作为研究对象，共60 例，采用随机数字表法分为观察组和对照组，各30 例。两组患者的性别、年龄和病程等临床资料经比较，差异无统计学意义（表1）。另取10 例造血干细胞供者作为正常对照组，其中男性7 例，女性3 例。本研究通过了山东中医药大学附属医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

表1 两组患者一般资料比较Table 1. Comparison of the baseline characteristics between the two groups（n=30）

2 方法

2.1 分组和药物治疗 对照组：给予最佳的支持治疗［3］，即根据患者病情给予必要的基础支持治疗，包括输血治疗和细胞因子治疗等。观察组：在对照组的基础上，给予我院院内制剂芪莲益髓清毒颗粒（鲁药制字Z20130002，专利号ZL201310227800.2）治疗。芪莲益髓清毒颗粒药物组成：黄芪、地黄、半枝莲、太子参、黄精、天冬、白术、白花蛇舌草、女贞子、旱莲草、麦冬、蒲公英、小蓟、茯苓、甘草；服用方法：每袋3 g，每次3 袋，每日3 次。上述方案共治疗6 个月后观察疗效。

2.2 疗效评价 中医证候积分标准［2］：对MDS 的症状进行分级量化评价，没有感觉，计0 分；稍有感觉，计1分；感觉较重，但可耐受，计2分；感觉严重，不可耐受，计3分。西医疗效标准：采用2006修订的MDS国际工作组疗效标准，将完全缓解（complete respanse，CR），部分缓解（partial responese，PR），血液学改善（hematological improvement，HI）计入总有效率；将疾病稳定（disease stability，SD）和疾病进展（disease progression，PD）视为治疗无效。

2.3TET2和IDH1mRNA的表达检测 抽取各组患者骨髓标本3 mL，EDTA 抗凝，经淋巴细胞分离液（天津灏阳公司）梯度离心分离骨髓单个核细胞，用RNA/DNA 提取试剂盒（青岛浩赛公司）抽提RNA。实时荧光定量PCR 法（Roche LightCycler 480 PCR仪）检测TET2和IDH1mRNA 的表达。反应条件：95 ℃3 min；95 ℃10 s，60 ℃15 s，45 个循环。引物序列见表2。

表2 RT-qPCR引物序列Table 2. Primer sequences for RT-qPCR

2.4TET2和IDH1基因甲基化检测 骨髓标本处理同上，收集细胞提取DNA。甲基化特异性PCR 法（MS-PCR）检测TET2和IDH1基因甲基化。DNA 重亚硫酸盐修饰及纯化（试剂盒购自北京天根）：热循环条件为95 ℃10 min，64 ℃60 min，4 ℃保持；按说明书步骤收集纯化后的DNA 溶液，进行甲基化特异性PCR 反应。反应条件为95 ℃5 min；94 ℃20 s，52 ℃30 s，72 ℃20 s，共35 个循环；72 ℃5 min。将产物进行电泳分析：制备凝胶，在第1 个胶孔内加入5 μL 的DNA Maker，其 他 胶 孔 内 加 入10 μL 混 有DNA 加样缓冲液的MSP 产物，电压120 V，运行时间30 min；取出胶块在凝胶成像仪（上海天能科技有限公司，Tanon 1600）上观察拍照。结果判定标准：甲基化阳性：只有甲基化引物扩增条带，或同时表达甲基化、非甲基化扩增产物条带；甲基化阴性：只有非甲基化引物扩增条带。甲基化引物序列见表3。

表3 MS-PCR引物序列Table 3. Primer sequences for MS-PCR

2.5 基于LC-MS 技术的芪莲益髓清毒颗粒物质基础检测 芪莲益髓清毒颗粒原方中草药400 g（购自山东中医药大学附属医院中药研究中心）机械粉碎，加入8 倍水浸泡30 min，煎煮40 min，再加入3 200 mL 水，煎煮40 min，合并滤液后低温旋蒸仪加压浓缩至1 600 mL，相对密度1.23，按照《中药饮片标准汤剂》中汤药浓度的标化计算，浓度为2.5 g/mL。罐装于250 mL 输液瓶中，灭菌后用0.22 μm 的过滤器除菌，取3 mL 作为送测样本，分为3 个组。液相色谱-质谱分析仪器为WatersTMNexera UPLC 超高效液相串联QE 高分辨质谱仪组成的液质联用系统，数据采集结果使用The Human Metabolome Database（HMDB）和Lipidmaps（v2.3）以及METLIN 数据库进行分析。

3 统计学处理

所有数据均采用SPSS 22.0 进行分析。计量资料采用均数±标准差（mean±SD）进行统计学描述，计数资料分析采用χ2检验，计量资料分析采用t检验或单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 两组患者症状平均积分比较

治疗前观察组与对照组相比无显著性差异。治疗后观察组和对照组较治疗前积分均显著降低（P＜0.01），观察组与对照组相比有显著性差异（P＜0.05），见表4。

表4 两组患者症状平均积分比较Table 4. Comparison of average symptom scores between the two groups（Meas±SD. n=30）

2 两组患者临床疗效比较

观察组30例病例中总有效率为63.33%，对照组总有效率为46.67%，差异有统计学意义（P＜0.05），见表5。

表5 两组患者临床疗效比较Table 5. Comparison of clinical efficacy between the two groups（n=30）

3 TET2和IDH1 mRNA的表达水平比较

观察组和对照组治疗前TET2和IDH1的mRNA表达水平均较正常对照组降低，经单因素方差分析，有显著性差异（P＜0.05）；观察组和对照组治疗后的TET2mRNA 表达水平显著高于治疗前（P＜0.01），仍较正常对照组降低（P＜0.05）。观察组和对照组治疗后的IDH1mRNA 表达水平显著较治疗前无显著差异；治疗后观察组IDH1mRNA 表达水平高于对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1、2。

Figure 1. Comparison of TET2 mRNA expression levels. Mean±SD.*P＜0.05，**P＜0.01 vs normal control group；△△P＜0.01 vs before.图1 TET2的mRNA表达水平比较

Figure 2. Comparison of IDH1 mRNA expression levels. Mean±SD.**P＜0.01 vs normal control group；△P＜0.05 vs before.图2 IDH1的mRNA表达水平比较

4 TET2和IDH1基因DNA甲基化情况比较

如表6 所示，30 例观察组MDS 患者治疗前有9例出现TET2基因DNA 甲基化阳性，治疗后有2 例出现TET2基因DNA 甲基化阳性，有7 例患者TET2基因DNA甲基化转为阴性，经χ2检验，治疗前后有显著差异（P＜0.05）。30例观察组MDS患者治疗前有5例出现IDH1基因DNA 甲基化阳性，治疗后有2 例患者IDH1基因DNA 甲基化阳性，有3 例患者IDH1基因DNA 甲基化转为阴性，经χ2检验，治疗前后无显著性差异（P＞0.05）。对照组治疗前后TET2和IDH1基因DNA 甲基化阳性率无改变。TET2和IDH1甲基化检测电泳图见图3。

表6 TET2和IDH1 DNA甲基化情况比较Table 6. Comparison of DNA methylation of TET2 and IDH1

Figure 3. Methylation of TET2 and IDH1. A：methylation of TET2；B：methylation of IDH1. u：product bands amplified by unmethylated primers； m： product bands amplified by methylation primers.图3 TET2和IDH1 DNA甲基化情况

讨 论

5 芪莲益髓清毒颗粒化合物中代谢物成分定性分析

通过LC-MS 检测，在芪莲益髓清毒颗粒样本中共筛选出3 336个代谢物，根据数据矩阵中代谢物信息定性分析，从中筛选出与DNA 甲基化相关的21 个化合物，见表7。

表7 通过高效液相色谱-电离/质谱法从芪莲益髓清毒颗粒中鉴定出21个化学成分Table 7. Twenty-one chemical constituents were identified from Qilian-Yisui-Qingdu granule by HPLC-i/MS

6 差异代谢物网络通路分析

本研究利用代谢物的KEGG ID 进行通路富集分析，应用超几何检验进行生物信息学分析，对代谢物参与的主要代谢途径与信号通路进行挖掘，显著性富集的KEGG Pathway 见图4，代谢物主要富集于癌症的中心碳代谢、氨基酸生物合成、蛋白质消化吸收、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸生物合成、柠檬酸循环、胰高血糖素信号通路、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、HIF-1 信号通路、精氨酸和脯氨酸代谢等。

Figure 4. Enrichment pathway of differential metabolites in Qilian-Yisui-Qingdu granule. A：histogram，P value of metabolic pathway is the significant enrichment of this metabolic pathway；B：bubble chart，ordinate is the name of metabolic pathway，abscissa is enrichment factor（the larger the enrichment factor is，the greater the enrichment degree is）；the color from red to green indicates that the P value decreases in turn（the larger the dot is，the more metabolites are accumulated in the pathway）.图4 芪莲益髓清毒颗粒样本差异代谢物富集通路

在疾病治疗过程中，中医学强调辨证论治，即根据患者的症状和体征采用联合治疗策略来治疗疾病。中药复方由多种中药组成，多种成分可以作用于多个靶标并发挥协同治疗作用［4］。本项研究中，我们重点观察了芪莲益髓清毒颗粒对MDS 的疗效，以及它对DNA甲基化的影响。

随着高通量基因芯片技术的大量研究表明［5］，DNA 甲基化是MDS 发生与发展过程中常见且最为重要的修饰方式之一，并对其治疗和预后有重要意义。基因表达的表观遗传调控多发生在DNA、组蛋白和RNA 水平，很多人类血液肿瘤疾病的病理基因表达与异常的表观遗传甲基化修饰有关［6-7］。DNA高度甲基化可表现为多种基因发生突变，其中以抑癌基因TET和IDH等的突变最为重要，这些抑癌基因的沉默与其启动子区（CPG）的高甲基化有关，从而导致了MDS 的发生发展［8-9］。赖氨酸或精氨酸残基在组蛋白甲基转移酶（histone methyltransferase，HMT）的催化下，会导致甲基化的发生。组蛋白去甲基酶为黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，FAD）依赖的氧化酶，可分为赖氨酸特异性去甲基酶（lysine specific demethylase，LSD）家族和含有jumonji 结 构 域（jumonji domain-containing protein，Jmjc）的家族蛋白。Jmjc家族去甲基酶使用α酮戊二酸酯（α-ketoglutarate，αKG）作为酶激活的辅助因子，其中催化辅助因子FAD 和αKG 由三羧酸代谢途径生成。同样，DNA 去甲基化酶TET 家族蛋白的激活也需要FAD 和αKG。因此，线粒体中的三羧酸代谢途径可以直接参与基因组的表观遗传调控。

TET基因包括3种，分别是TET1、TET2和TET3。研究显示［10-12］，TET2突变常见于多种恶性血液病，如MDS、急 性 髓 性 白 血 病（acute myeloid leukemia，AML）和慢性粒单核细胞白血病（chronic myelomonocytic leukemia，CMML）等，其突变率约在19%～23%之间。TET2基因突变可导致DNA 发生高度甲基化，其发生机理是TET2基因突变使其正常生理功能丧失，从而使5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5-hmC）的生成量减少。TET2作为一种抑癌基因，可促进DNA 去甲基化，在DNA 甲基化和表观遗传学方面调控基因表达，在血液肿瘤疾病发生发展中起到重要作用。TET2基因突变会促进其启动子区甲基化，DNA 发生高度甲基化则促使疾病发生。但对于TET2基因突变对MDS 患者的预后影响仍存在争议。Kosmider 等［13］报道，TET2突变是MDS 中有利的预后因素，无TET2突变的患者死亡率上升，预后较差。Jiang 等［14］运用二代测序法对159 例MDS患者15 个MDS 相关基因的分子结构进行检测，显示TET2变异等位基因频率较高（＞18%）的患者与变异较低的患者以及没有TET2突变的患者相比总生存率明显缩短。同时，有研究对90 例MDS 患者进行TET2基因突变检测，结果表明患者生存率在不同基因型之间并无统计学差异［15］。Lee 等［16］观察到伴有TET2突变的MDS 经8 周期去甲基化治疗，三年后转化为急性髓系白血病概率降低。

IDH 是在细胞能量代谢中起着重要作用的三羧酸循环限速酶，参与细胞的氧化还原及代谢、DNA 的损伤修复等重要活动，包括IDH1、IDH2和IDH3。代谢酶的突变使细胞发生恶性变，最终影响DNA 和组蛋白的表观遗传学调控，导致肿瘤发生。烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP+）依赖的异柠檬酸脱氢酶（IDH1 和IDH2）、琥 珀 酸 脱 氢 酶（succinate dehydrogenase，SDH）和延胡索酸水合酶（fumarate hydratase，FH）突变频繁。这些代谢酶的失活突变导致2-羟基戊二酸盐、琥珀酸盐和富马酸盐分别堆积。琥珀酸和富马酸都抑制TET 和Jmjc 家族蛋白的酶活性。携带IDH1/IDH2突变的癌细胞表现出DNA 和组蛋白的高甲基化，在胶质瘤和恶性血液病中常见。有研究表明［17］，IDH基因突变（主要为IDH1的突变）是影响MDS DNA 甲基化的重要基因之一，尽管其在MDS 患者中检出率较低。王燕梅［18］在对15 例MDS 患者基因检测中未观察到IDH1突变，在复发难治性白血病患者中发现IDH1突变率较高且与预后不良相关。Wang［19］等通过基因组测序技术检测97 例MDS 患者骨髓标本发现其突变率为7.2%，在难治性贫血患者中突变率较高（16.6%），与较高的骨髓细胞计数和较低中性粒细胞计数相关，提示预后不良。

本研究结果显示，IPSS-R低危MDS患者TET2和IDH1mRNA 表达较正常人显著减少，芪莲益髓清毒颗粒可以上调TET2和IDH1mRNA的表达。TET2和IDH1作为抑癌基因，通过促进DNA 去甲基化发挥其抑癌作用。当TET2和IDH1表达下调时，DNA 去甲基化作用减弱，DNA 异常的高甲基化导致了MDS 的发生与发展。本研究对观察组IPSS-R 低危MDS 患者治疗前后的骨髓单个核细胞的TET2和IDH1DNA甲基化进行了检测，经过芪莲益髓清毒颗粒治疗后，TET2甲基化阳性率由30%下降为6.7%，IDH1甲基化阳性率由16.7%下降为6.7%；而对照组甲基化阳性率没有发生改变。此结果与观察组治疗前后TET2和IDH1mRNA 的表达情况相吻合，提示DNA去甲基化可能是其作用机制之一。此外，本研究TET2甲基化阳性率、IDH1甲基化阳性率接近或略高于报道的突变率［14-15，19］，前面提到，TET2和IDH1的高突变会使细胞过度甲基化，另一方面，DNA 甲基化亦往往会导致该碱基突变率的增加，这是表观遗传变异影响遗传变异的一个重要方面，可见，DNA 甲基化与基因突变关系较为密切，相互影响，但由于发病机制不同，二者虽有关联但不能等同。芪莲益髓清毒颗粒由益气养阴方化裁而来，功效益髓补气养阴，清热解毒止血，适用于由气虚、阴虚、骨髓衰竭、热毒内伏、暗耗阴血等引起的头晕、乏力、倦怠、心悸、衄血等症状的骨髓异常增生综合征患者。方中太子参益气生津，入肺、脾二经；熟地黄滋补肾阴，补益精髓，归肝、肾经，二者合用使气旺精生，共为君药。黄芪助太子参益卫固表；黄精益气养阴，入脾肾二经；半枝莲、白花蛇舌草清热解毒；女贞子、旱莲草既可滋肝补肾，又可清热止血，共为臣药。佐以天冬、麦冬，补益肺胃之阴，肺阴足则能生肾水；蒲公英佐助白花蛇舌草、半枝莲增强清热解毒、消肿散结之效；小蓟凉血止血，与补气药合用则止血而不留瘀；茯苓、白术健脾利湿、顾护脾胃，既可防君药的滋腻之性损伤脾胃的同时可佐制清热药的苦寒之性；甘草调和诸药，为佐使药。诸药配伍，共奏益肾填髓解毒之效。我们前期研究观察到，益气养阴方通过作用于线粒体凋亡因子细胞色素C（cytochrome C，Cyt-C）、凋亡诱导因子（apoptosis-inducing factor，AIF），有丝分裂蛋白、人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）启动子区甲基化等作用机制促进小鼠白血病细胞凋亡［20-22］。且芪莲益髓清毒颗粒联合传统化疗在急性白血病的治疗中有增效减毒的作用［23］。现代药理研究显示，女贞子含药血清在一定程度上有逆转p16基因高甲基化的作用［24］。研究证实［23-27］，半枝莲和白花蛇舌草可以抗肿瘤，其含有的野黄芩苷、野黄芩素和槲皮素等黄酮类活性物质是其抗肿瘤作用的物质基础，抑制肿瘤干细胞在体内外的分化是其机制之一。观察组在改善中医证候积分方面优于对照组，且不良反应发生率低于对照组，其能更好的改善气短、头晕乏力和纳呆等中医症状，可能与芪莲益髓清毒颗粒中黄芪、太子参等补气扶正药物作用相关，并进一步验证了其增效减毒作用。

液相色谱质谱联用技术是目前常用的代谢组学技术，结合代谢组学数据处理软件可对质谱信息进行解析，在单次分析中可检测和鉴定几百至几千种中药代谢物。近年来，LC-MS 成为分析中药复方中草药成分化合物的必不可少的工具。我们通过LCMS 法从芪莲益髓清毒颗粒提取物中鉴定出与DNA甲基化相关的21种代谢物，并通过KEGG pathway 富集分析显示，筛选出的代谢物作用靶点主要作用于三羧酸循环、癌症的中心碳代谢、丙氨酸代谢、天冬氨酸代谢、谷氨酸代谢、低氧诱导因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）代谢、胰高血糖素信号通路等。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）、胰岛素、胰岛素分泌通路都可以直接参与糖脂代谢的高甲基化［28］。谷氨酸和乳酸都是丁酸盐的前体，能够通过DNA 甲基化改变结肠粘膜组织中的基因表达［29］；精胺可以逆转鸟氨酸脱羧酶抑制引起的变化，脱羧S-腺苷甲硫氨酸增加，DNA 甲基转移酶活性降低，异常DNA甲基化增加［30］；L-精氨酸可以通过调节IL-10 启动子DNA 甲基化来调节新生儿调节性T 细胞（regulatory cells，Tregs）［31］；延胡索酸可以作为细胞渗透制剂代谢物，影响CD4 T 细胞表观全基因组DNA 甲基化变化［32］；抗坏血酸和L-脯氨酸，影响着胚胎干细胞的DNA 甲基化、转录谱和能量代谢［33］；胆碱作为蛋氨酸循环营养素可以提供DNA 甲基化反应的甲基基团，直接改变基因的表观遗传调控［34］；丙酮酸盐能够通过DNA 甲基化至少部分参与组蛋白去乙酰化，抑制宫颈癌细胞的发展［35］。这些化合物的检出，为芪莲益髓清毒颗粒治疗MDS提供了靶向依据。

近年来，开发治疗癌症药物的进展主要集中在阻止癌细胞有效代谢途径的抑制剂上，针对某些关键代谢酶活性的抑制剂具有很大的研究潜力。一些与癌细胞存活和进展有关的代谢途径如线粒体代谢、DNA 甲基化代谢、糖酵解和自噬等为靶点，为新药物的开发提供了有效策略。我们研究结果显示，芪莲益髓清毒颗粒的有效组分功能有助于与多个目标相互作用，并在治疗MDS 甲基化过程中发挥协同作用，有助于提高MDS的治疗效果。综上，芪莲益髓清毒颗粒治疗MDS 是有效的，可以作为MDS 治疗的一种可选的补充疗法。