60Coγ辐射柱花草M3代的农艺性状及遗传多样性分析

罗铭欣, 刘凤民, 陈纪言,3, 崔均涛, 张伟丽,3*

(1.仲恺农业工程学院农业与生物学院， 广东 广州 510225; 2.仲恺农业工程学院教学科研基地管理中心， 广东 广州 510225;3.德庆仲恺农业产业科技创新研究有限公司， 广东 肇庆 526642; 4仲恺农业工程学院园艺园林学院， 广东 广州 510225)

柱花草(Stylosanthesspp.)是一种热带豆科牧草，其茎叶产量大、营养价值高、适应性强、耐酸性土壤，具有固氮、改良土壤和涵养水土的作用，可用作绿肥作物、青饲料等[1-2]。柱花草起源于哥伦比亚和巴西，主要分布在南美洲，现已被推广于我国的干热河谷地区，成为我国热带草业的优势豆科牧草，并有“北有苜蓿，南有柱花草”之说[3-4]。

辐射诱变育种是利用理化因素(如X射线、γ射线等)在短时间内撞击生物体辐射其敏感部位发生电离而引起DNA结构的变化，进而使其产生新的突变体，用于辅助新品种的改良和培育[5-6]。分子标记技术可直接反映DNA分子水平的遗传变异，能阐述植物间的遗传关系，可为杂交育种中的亲本选配提供理论依据。CDDP是基于DNA保守序列的分子标记技术，其PCR扩增产物可直接用琼脂糖凝胶电泳进行分离，具有成本低、目标性强、稳定性高等优点[7]。SRAP是一种利用独特的双引物对开放阅读框进行扩增的标记技术，具有测序简便、有适度的吞吐比、高共显性、适用于基因的定位等优点[2,8]。传统表型选择可能会丢失一些表型较差个体所携带的优良低频基因，而分子标记则能有效地寻找和定位这些基因[9]。每种分子标记都有自身的长处和不足，采用不同分子标记技术得出的多态性结果也存在差异，所以本研究同时运用CDDP和SRAP标记对经60Coγ射线辐射的17份柱花草M3代种质进行遗传多样性分析，以期更加准确地寻找和定位这些优良基因。

目前，关于柱花草遗传多样性的研究多利用SRAP[2,10]，SSR[11]，SSR和SRAP[3,12]，RAPD[13-16]，AFLP[17]，RFLP[18]，RFLP和STS[19]，ISSR[4]等分子标记方法进行遗传差异分析，但尚未见CDDP标记应用于柱花草的报道，且目前应用SRAP标记确定辐射变异后柱花草的遗传多样性分析较少，仅有刘凤民等[20]和张伟丽等[21]利用SRAP分析辐照后柱花草M1代和M2代确定辐射后柱花草在分子水平的变异，经辐照处理的种子会产生生物学效应，在M1代通常会出现形态畸变、生理损伤和DNA损伤等，而在M2代将确定优秀变异植株作为目标株系，在M3代继续观察筛选出目标突变株。

本研究对60Coγ射线辐照后的M3代柱花草进行农艺性状统计，并采用CDDP和SRAP标记对17份M3代柱花草种质进行遗传多样性分析，这将有利于优良柱花草种质的发掘，并对分子标记辅助柱花草的辐射诱变育种工作具有一定的指导意义，为柱花草种质资源的利用、亲本选择以及品种改良提供材料基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用柱花草品种为‘Nchp1’、‘热研2号’(‘Reyan No.2’)、‘热研13号’(‘Reyan No.13’)的种子，经剂量为974Gy的60Coγ射线辐射诱变处理后种植[20]，连续2代对自然生长的植株通过株高、干重、花期、炭疽病的病害级数等主要指标的测定与分析进行筛选，选取出13份上述性状优良的单株，以及‘Nchp1’在自然生境下株型发生变异的Nchp401，加上3个未进行辐照的亲本材料，共计17份柱花草种质作为试验材料(表1)，其中以‘Nchp1’，‘ReyanNo.2’为对照1，2。

表1 供试柱花草种质资源信息

SRAP的正反引物是根据Li等[22]提出的原则构建引物，SRAP的正反引物一一相互配对组成80对SRAP引物，而CDDP引物则参照Collard和Mackill[23]公布的引物序列，CDDP引物和SRAP引物序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表2)。

表2 CDDP和SRAP引物序列

1.2 试验方法

1.2.1农艺性状的测定及统计分析 将筛选得到的17份M2代柱花草品系的种子浸泡于80℃的热水中处理3～5 min，冷却后再次浸泡于稀释800倍的复方多菌灵(多硫) 溶液中消毒30 min，然后流水冲洗，在育种盘中播种，置于温室大棚中，3个月后移栽到仲恺钟村的农场试验基地，每份材料分别种植在农场2个不同的区域，分为一区与二区，每个区域对每份材料设置3个重复，移栽5个月后测定柱花草材料的株高、冠径、分支数、第一分支长、病害级数5个指标，而病害级数是对柱花草炭疽病的观测，采用Chakraborty Sukumar提供的0～9级的标准对柱花草炭疽病进行统计[24]。分别记录柱花草的开花期后，并于移栽后的7个月对其进行刈割，经烘干后称量单株的干重。试验数据采用IBM SPSS Statistics 22软件进行分析。

1.2.2基因组DNA的提取与检测 称取健康新鲜的柱花草嫩叶0.2 g，使用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒提取17份柱花草的DNA，所得DNA浓度与纯度用超微量分光光度计进行检测与分析。

1.2.3CDDP-PCR和SRAP-PCR扩增反应体系的确定 通过单因子试验对柱花草CDDP-PCR反应体系的模板DNA量、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶量设置不同的梯度水平，在反应过程中上述5个因素逐一变动时保证其余反应条件不变，通过观察扩增条带的清晰度、特异性的丰富度来确定最佳的反应体系。用引物WRKY-R3B对样品‘RY13fszh001’的DNA扩增，通过单因子试验确定柱花草CDDP-PCR的反应体系为：反应总体积为20 μL，其中DNA模板75 ng、Taq DNA聚合酶1.5 U、10×Buffer(含Mg2+2.0 mmol·L-1)2.5 μL，0.6 mmol·L-1dNTPs 1.2 μL，0.3 μmol·L-1引物浓度1 μL，用ddH2O补足剩余体积。CDDP-PCR扩增程序：94℃预变性3 min；94℃变性1 min、50℃退火1 min、72℃延伸2 min、循环35次；最后72℃延伸5 min；4℃保存。

SRAP-PCR的反应体系和扩增程序参考刘凤民等[20]的方法。反应总体积为25 μL，其中DNA模板1 μL、5 U·μL-1Taq DNA聚合酶0.625 μL、10×Buffer(含Mg2+2.0 mmol·L-1)2.5 μL、2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL、10 μmol·L-1上下游引物浓度1 μL，用ddH2O补足剩余体积。SRAP-PCR扩增程序：94℃预变性4 min；94℃变性1 min、33℃退火1 min、72℃延伸10 s、循环5次；94℃变性1 min、50℃退火1 min、72℃延伸10 s、循环30次；最后72℃延伸5 min；4℃保存。

1.2.4PCR产物分离 CDDP与SRAP标记PCR扩增产物分别采用浓度为1.5%与2.0%的琼脂糖凝胶电泳进行分离检测，使用Tanon 4100凝胶成像系统观察并拍照记录。用80对SRAP引物对17份柱花草种质进行PCR扩增，电泳筛选出26对能扩增出清晰条带、多态性高的引物。

1.2.5数据处理 人工分析电泳图谱，在相同迁移位置上，有清晰可辨认的条带记为“1”，无带记为“0”，以此构建二元数据矩阵。

运用NTSYS-pc 2.1统计分析软件计算样品间的遗传相似系数(GS)、遗传距离(GD)，按照非加权配对算术平均法(UPGMA)对所有样本作聚类分析。

2 结果与分析

2.1 17份柱花草农艺性状的统计分析

17份柱花草的株高、冠径、分枝数、第一分支长、病害级数、开花期、单株干重7个农艺性状的统计结果见表3，其中‘RY13fszh001’株高最矮，显著矮于‘Nchpfszh0020’，‘Nchpfszh0021’，‘Nchpfszh01102’，‘Nchpfs1’，‘RY2fszh001’，‘Nchpfszh003’，‘Nchpfszh006’，‘Nchpfszh008’，‘Nchp401’(P<0.05)。冠径最宽的种质为‘Nchpfszh0020’，其次为‘Nchpfszh01102’。分支数最多的种质是‘RY2fszh001’，其次是‘Nchpfszh01102’，‘Nchpfszh004’和‘Nchpfszh0021’，再者是‘Nchpfszh003’和‘Nchpfszh0020’，只有‘RY2fszh001’显著多于其余的11份种质(P<0.05)。‘Nchpzh021’的第一分支长最短，和其余16份柱花草种质差异显著(P<0.05)。单株干重位列前六的种质分别为‘Nchpfszh01102’，‘Nchpfszh0020’，‘Nchpfs1’，‘RY2fszh001’，‘Nchpfszh017’，‘Nchp1’，均显著重于余下的11份种质。‘Nchpfszh0020’，‘Nchpfszh01102’，‘Nchpfs1’，‘Nchpfszh017’，‘RY2fszh001’这5个种质的单株干重都高于对照1,2，而‘Nchpfszh0020’，‘Nchpfszh01102’，‘Nchpfs1’，‘Nchpfszh017’的单株干重分别比其辐射亲本Nchp1(对照1)高出93.0%，93.9%，76.9%，12.4%，‘RY2fszh001’的单株干重亦比其辐射亲本‘Reyan No.2’(对照2)高出83.4%，每种农艺性状都出现好于亲本或对照的情况，呈现了经辐射筛选后的多样性和定向性。

炭疽病是柱花草最大的病害，对柱花草的产量危害极大，会导致柱花草顶芽病变和坏死。选育出病害级数小的柱花草种质可以防治炭疽病，由表3可知，病害级数最小的种质为‘Nchpfszh01102’和‘ReyanNo.13’，病害级数为0，说明‘Nchpfszh01102’和‘ReyanNo.13’有较强的炭疽病抗病性。17份柱花草种质的开花期均集中在10—11月，其中花期最早的种质为‘Nchpfs1’在10月10日即开花，‘Nchpfszh0020’紧跟其后在10月12日开花，‘Nchpfszh01102’，‘RY2fszh001’，‘Nchpfszh003’紧接着也在10月13日开花了，以上5份种质的花期均早于其辐射亲本，辐射后代的花期提前可以让种植在广东的柱花草有效地避开寒潮的到来，避免被冻伤甚至影响正常的结籽。

表3 柱花草M3代各种质的农艺性状

2.2 17份柱花草基因组DNA纯度及浓度检测

超微量分光光度计的测量结果显示17份柱花草基因组DNA的A260/A280稳定在1.74～1.81之间，而A260/A280在1.80左右则显示DNA较纯，没有被降解或被RNA、多糖、蛋白质、酚等污染，也没有其他小分子杂质的残留，DNA的浓度在64.86～142.76 ng·μL-1之间，测量数据表明提出来的柱花草基因组DNA纯度高、质量稳定能满足分子标记分析的要求。

2.3 柱花草种质多态性分析

2.3.1CDDP标记多态性分析 如表4所示，通过CDDP的17条引物对17份柱花草种质进行扩增检测到的条带有92条，平均每条引物扩增出5.4条带，多态性条带数为66条，多态性比率高达71.7%，其中特异性条带数为13条，特异性比率为14.1%。其中WRKY-R3与WRKY-R3B扩增条带数最多，均为8条，KNOX-2的扩增条带数目最少，只有3条，其多态性条带数也是最少，仅扩增出1条，而WRKY-R1的特异性条带最多，达到了3条。另外，多态性比率达100%的引物有WRKY-R3,MADS-2,ABP1-3。引物WRKY-R1对17份柱花草的扩增结果见图1。

图1 引物WRKY-R1对17份柱花草种质的PCR扩增结果

2.3.2SRAP标记多态性分析 从80对SRAP引物中筛选出26对扩增效果较好的引物组合对17份柱花草种质进行扩增，如表4所示，共扩增出177条带，平均每对引物扩增出6.8条带；多态性条带有111条，多态性比率为62.7%；特异性条带共计29条，特异性比率为16.4%。其中引物组合ME7EM4扩增出的条带数目最多，达12条，而引物组合ME7EM1仅扩增出3条带。ME7EM4，ME8EM2与ME8EM5扩增出的多态性条带数最多，均为7条，而ME3EM3，ME7EM1和ME7EM6扩增出的多态性条带最少，只有2条。ME2EM2，ME6EM4和ME8EM2扩增出多态性条带比率最高，均达到100%，而ME2EM8，ME4EM4扩增出多态性条带比率最低，均为45.5%。引物组合ME7EM4对17份柱花草的扩增结果如图2所示。

图2 引物组合ME7EM4对17份柱花草种质的PCR扩增结果

2.3.3CDDP和SRAP标记系统的多态性比较 如表4所示，从引物覆盖的条带来看，SRAP的平均覆盖条带数(6.8条)高于CDDP(5.4条)，且SRAP的特异性比率(16.4%)也高于CDDP(14.1%)，而CDDP的多态性比率(71.7%)高于SRAP(62.7%)(表4)，两种分子标记均能扩增出较为丰富的多态性条带，说明筛选出的CDDP引物和SRAP引物适用于柱花草的种质鉴定。

表4 17份柱花草种质遗传多样性分析

2.4 基于CDDP和SRAP标记分析结果下柱花草的遗传相似性

CDDP扩增结果如表5所示，样本间遗传相似系数在0.54～0.90之间，平均遗传相似系数(GS)为0.76，平均遗传距离(GD)为0.24。最大遗传相似数0.90出现在‘Nchpfszh006’和‘RY2fszh001’之间，说明二者的亲缘关系较近，最小遗传相似系数0.54出现在‘Nchpfs1’和‘Nchpzh021’之间，表明两者的亲缘关系最远。

表5 基于CDDP分子标记柱花草的遗传相似系数

SRAP扩增结果如表6所示，样本间遗传相似系数范围是0.60～0.94，说明17份柱花草种内有较大的遗传分化，平均遗传相似系数(GS)为0.79，平均遗传距离(GD)为0.21。‘Nchp401’与‘Nchpfszh017’，‘Nchp401’与‘Nchpfszh004’的遗传相似系数均为0.60最小，说明‘Nchp401’和两者的遗传距离相近；‘ReyanNo.13’和‘ReyanNo.2’的遗传相似系数最大，为0.94，说明两者的亲缘关系最近，两者之间可能拥有更多相同的基因组类型。

表6 基于SRAP分子标记柱花草的遗传相似系数

2.5 基于CDDP标记和SRAP标记联合的柱花草聚类分析

由图3所示，聚类分析显示辐射后的M3代柱花草与亲本产生了一定的变异。系数在0.71时，将17份柱花草种质分为2类，其中株型特殊、自然逆境突变的‘Nchp401’单独聚为类群I，剩余16份柱花草种质聚为类群II。在系数为0.82时又被分为7小类，‘Nchpfszh0020’和‘Nchpfszh0021’聚为一类，其株高、冠径、分支数、第一分支长、病害级数均没有显著差异；而未经过辐射的‘Reyan No.2’与‘Reyan No.13’紧密聚为一类，两者的花期较晚，在试验的17份柱花草中仅此2份品种是11月初才开花的；病害级数没有显著差异的‘Nchpzh021’和‘Nchpfszh01102’聚为一类，其与农艺性状中没有显著差异的另一聚类‘Nchpfszh017’和‘Nchpfszh004’聚为一大类；辐射亲本‘Nchp1’与其辐射后代‘Nchpfszh003’，‘Nchpfszh006’聚为一类，很好的反映了辐照亲本与辐照后代的亲缘关系，而农艺性状没有显著差异的‘Nchp1’和‘Nchpfszh006’又紧密聚类；‘RY2fszh001’，‘RY2fszh002’，‘Nchpfszh008’，‘RY13fszh001’聚为一类，其中‘RY2fszh001’和‘RY2fszh002’的辐射亲本相同聚在一起，而除了开花期与株高有差别以外，其他农艺性状均没有显著差异的‘Nchpfszh008’和‘RY13fszh001’也聚在一起；‘Nchp401’和‘Nchpfs1’的单独聚类说明自然逆境和60Coγ射线辐射均能引起种质一定程度的遗传变异。

图3 基于CDDP标记和SRAP标记联合的柱花草聚类分析

3 讨论

种质资源的遗传多样性是作物育种能够取得突破性结果的关键[25]。遗传多样性是遗传育种的基因源泉，是一个物种是否能适应环境变化的决定因素。柱花草是自花授粉植物，杂交育种较难，育种主要依靠人工手段，而利用60Coγ射线辐射柱花草的种子育种，能够诱导柱花草产生变异，可减轻育种的工作量与年限。分子标记是辅助育种的重要工具，CDDP标记是一种目的基因标记技术，其操作简单，其引物来自转录因子基因家族，能涉及到抗病、发育、代谢等性状。SRAP技术操作简单、高效、稳定性好、多态性高，不需阈预知物种的序列信息，在许多植物中都可以利用，这使得SRAP技术在遗传多样性分析品种鉴定，指纹图谱构建等多个领域得以应用。丁泽婷等[12]利用SSR和SRAP对20份柱花草品种进行重要性状的关联分析。任羽等[26]利用SRAP分子标记对60Coy射线处理后的石解兰组培苗进行分析，认为SRAP分子标记能有效地揭示诱变材料的遗传多样性。本研究首次利用CDDP分子标记分析柱花草辐射M3代的遗传多样性，能将其很好的区分开。CDDP和SRAP引物对17份柱花草种质扩增的多态性比率分别为71.7%和62.7%，表明经过60Coγ射线辐射后17份柱花草种质间存在丰富的遗传变异，两种分子标记的遗传相似系数各为0.76和0.79，说明辐射处理对柱花草材料存在诱变作用，蒋昌顺等[12]的多样性水平低于本研究的多态性水平，考虑是种质、引物的不同所引起的，也说明了CDDP和SRAP分子标记技术在柱花草属植物遗传多样性研究中有较高的检出效率，是鉴定柱花草种质和研究遗传多样性的理想方法。白昌军等[15]采用太空诱变的方式对‘热研2号’柱花草进行诱变后利用RAPD分子标记技术进行遗传性分析，其多态性比率68.8%低于本研究CDDP的多态性比率为71.7%，说明经过60Coγ射线辐射处理后的柱花草增大了变异率，提供了更宽的遗传筛选范围，经过3年的单株选择筛选出的柱花草M3代已发生了不同程度的变异，产生了许多比亲本优良的农艺性状，如炭疽病病害级数小和花期提前的柱花草种质，这些变异材料的选择丰富了柱花草种质的基因类型，极有可能从中开发出比亲本更优良的柱花草种质，有望为高产、优质的柱花草品种选育提供新种质。

CDDP-PCR反应体系中成分浓度变化会影响扩增结果[27]，因此本试验优化了柱花草CDDP-PCR反应体系，为今后运用CDDP标记开展柱花草遗传多样性、杂交育种等方面的相关研究提供了依据。SRAP引物一般采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，但本试验中用琼脂糖凝胶即可取得较好的分离效果，说明对于柱花草材料，SRAP分子标记可以采用琼脂糖凝胶电泳的方法进行分离。聚类分析是种质资源表型多样性研究中较为普遍有效的分析方法[28]，在进行分析的时候为了得到更准确的聚类结果，用不同分子标记联合对亲缘关系进行评价能有效减少单一标记造成的误差。应用CDDP和SRAP标记聚类分析结果可知，柱花草的亲缘关系与农艺性状有一定的相关性，农艺性状相似的更容易紧密的聚类，分类结果与农艺性状统计结果较一致，联合两种标记方法能准确地分析辐射后柱花草的亲缘关系，对后续的育种和利用提供一定的参考价值。

4 结论

本研究利用60Coγ射线对柱花草种子进行辐射诱变，并运用CDDP和SRAP分子标记快速有效地对17份柱花草进行遗传多样性分析，经60Coγ射线辐射诱变后的M3代柱花草与其辐射亲本以及在自然逆境下突变的‘Nchp401’之间存在丰富的遗传差异，本研究从分子水平上对其进行遗传变异分析，明确其遗传距离，从分子水平上反映了辐射后代的变异性和差异性。结合其农艺性状进行选育，系数在0.71时，将17份柱花草种质分为2类，其中自然逆境突变的‘Nchp401’单独聚为类群I，剩余16个柱花草品种聚为类群II，其中类群II在系数为0.82时又被分为6小类，各小类群间农艺性状关系密切，因此在实际应用中可根据育种目标选择相应的亲本材料。本研究为柱花草辐射效应评价提供了分子依据，为柱花草的分子标记辅助辐照选育积累经验。