短期增温对青藏高原高寒草甸不同植物根际丛枝菌根真菌的影响

王谭国艳， 马志远， 李沛洋， 郭俊宏， 张嘉懿， 蒋胜竞*

(1. 兰州大学草地农业生态系统国家重点实验室/兰州大学农业农村部草牧业创新重点实验室/兰州大学草地农业与科技学院， 甘肃 兰州 730020； 2. 北京大学城市与环境学院， 北京 100871)

自工业革命以来，由于化石燃料的过多使用和人类活动的增加，全球气温正不断升高[1]。以全球气温升高为主要特征的气候变化问题正改变着陆地生态系统的结构和功能，影响人类的生存和健康[2-3]。青藏高原作为地球上海拔最高和面积最大的高原对气候变化尤为敏感[4]。近些年，许多研究证实了气候变暖不仅会改变植物物候[5]及群落组成[6]，对土壤微生物的多样性及功能同样也具有重要影响[7-8]。然而，关于土壤微生物的重要类群之一的丛枝菌根(Arbuscular mycorrhizae，AM)真菌如何响应气候变暖的研究相对较少。

丛枝菌根真菌隶属于球囊菌门(Glomeromycota)，在自然界中广泛分布，可以与陆地生态系统中80%以上的高等植物建立共生体系，形成菌根结构[9]。在菌根共生体中，AM真菌不仅能够促进植物对矿质营养(磷素和氮素等)的吸收、增强植物抗逆抗病等生理作用[10]，还会影响植物的群落组成[11-13]。此外，菌根真菌还能够影响土壤细菌群落结构[14],稳定土壤结构[15]，促进土壤养分循环[16]。AM真菌有重要的生理生态功能，但目前对AM真菌如何响应气候变暖还没有一致的结论。

AM真菌的生长只能在一定的温度范围内进行并且具有最适的生长温度，因此温度上的任何变化都会直接影响AM真菌。例如，Heinemeyer等在2004年曾发现温度升高可以促进AM真菌根外菌丝的生长[17]。此外，因AM真菌对宿主植物或土壤环境具有一定的选择性[18-20]，所以气候变暖也可以通过改变植物群落结构或土壤性质从而影响AM真菌[21-22]。近些年，学者在青藏高原针对AM真菌对气候变暖的响应做了大量研究[23-26]。如Jiang等[24]和Wei等[26]发现，AM真菌的多样性及群落结构并不受温度升高的显著影响，而Shi等却发现模拟增温降低了AM真菌的多样性，但对AM真菌的群落组成没有显著影响[25]，这一结果与Yang等在2013年的研究结果相反，他们发现模拟增温虽然对AM真菌的多样性没有显著影响，却显著影响了AM真菌的群落组成[23]。作为专性共生菌，AM真菌的群落组成与植物群落特征密切相关，不同的植物群落组成可能影响了AM真菌对模拟增温的响应。因此，在植物物种水平上探究AM真菌对模拟增温的响应，继而得出普遍性规律对AM真菌的研究至关重要。

近些年由于高通量测序技术的快速发展，对AM真菌的研究大多集中于土壤或根系的分子学研究，对以AM真菌孢子形态鉴定为主的报道相应减少。然而，AM真菌孢子作为重要的繁殖体，无论在AM真菌种群生长或是群落构建中都具有重要作用。此外，形态鉴定的方法较分子鉴定方法具有更好的直观性，这一方法避免了因核酸提取及PCR反应等实验所带来的误差，因此对探究气候变暖对AM真菌孢子的影响仍具有重要意义。本试验借助野外模拟增温平台，以盆栽的单物种植物为研究对象，通过探究模拟增温对不同植物根际土壤AM孢子组成的影响，旨在探讨不同植物根系AM真菌孢子的分布模式及差异以及在植物物种水平上AM真菌如何响应模拟增温。

1 材料与方法

1.1 研究地点概况

本项目在中国科学院海北高寒草甸生态系统定位研究站(北纬37°37′，东经101°19′，海拔3 200 m)进行。该研究站地处青藏高原东北隅祁连山区门源县境内。该地气候类型属于高原大陆性气候，具有典型的高原寒温湿润性气候特征。海北站所在地区主要的土壤类型包括高山草甸土、高山灌丛草甸土和沼泽土主要为草毡寒冻雏形土(高山草甸土)[27]，土壤中有机质贮量丰富，氮、磷绝大部分以有机态形式存在，矿化作用较弱[28]。该地区为典型的以嵩草属植物为建群种的高寒嵩草草甸[29]，主要物种有矮嵩草(Kobresiahumilis)，羊茅(Festucaovina)，垂穗披碱草(Elymusnutans)等[30]。

1.2 试验设计

本研究于2016年7月份原位选取高寒草甸常见的15种植物(表1)幼苗进行室外移栽试验，每盆4株幼苗，所选植株幼苗长势相近且无明显的病虫害。花盆直径为20 cm，埋入地下深度为60 cm，培养基质采用原位土与沙子按2∶1比例混合。本试验采取的增温方式为红外灯管(220 V，长1 m，宽2.2 cm)加热，灯管距地面距离1.2 m，增温幅度约为2℃；对照组仅设置同等规格的灯罩。每个处理设置6个重复，共计180个样品。

表1 本研究所选取的植物物种

1.3 样品采集

经过连续两年的增温试验后，于2018年8月底进行破坏性采样，采集花盆内的根际土壤样品，自然风干后进行AM真菌孢子的分离、计数与鉴定。AM真菌孢子的分离采用湿筛倾析-蔗糖离心法[31]并稍作修改，具体操作如下：称取25 g风干土壤于1 L的钢制烧杯中，加入1 000 mL的自来水，用玻璃棒快速搅拌，使得底部的土壤全部悬浮。静置3分钟后再次搅拌，如此反复3～4次，使得土壤的团聚体结构破碎，孢子全部释放到水中。最后搅拌使土壤颗粒悬浮后静置约7秒后将浑浊液迅速倾倒至两层筛网(上层孔径为200 μm，下层孔径为38 μm)过滤，将下层网筛上的过滤物转移到100 mL离心管中，3 000 r·min-1离心3 min后弃上清，加入50%(m/v)蔗糖溶液充分震荡后3 000 r·min-1离心7 s，此时AM孢子悬浮于蔗糖溶液层，而绝大部分泥沙沉在底部。将上层蔗糖溶液倒入孔径38 μm筛网的一侧，用自来水小心冲洗后将筛子上的孢子泥沙混合物快速的抽到滤纸上(直径7 cm)，转移到培养皿中，体视镜下用镊子小心将孢子挑取到一张新的做好标记的滤纸上。分离出的孢子样品放在4℃冰箱中(保持湿润)保存用于后续的试验。

1.4 AM真菌孢子的形态鉴定

将分离好的孢子取出，在体视镜下通过观察其颜色、大小、形状、有无连孢菌丝等特征将所有孢子做初步的聚类、拍照、计数。取载玻片，滴一滴Melzer-PVLG染液，用镊子将初步聚类的各组的孢子全部夹到染液中，用盖玻片盖上，大拇指轻轻按压，使尽可能多的孢子破壁以保证染液充分的进入孢内，使染色充分。在染液未干之前，在体视镜下拍照记录。观察孢子壁的层数、颜色、连孢菌丝的特征，通过与最新的分类信息(http://www.zor.zut.edu.pl/)比较，进一步将初步聚类的孢子进行物种鉴定。

1.5 统计分析

试验数据用Excel进行汇总整理，并用R语言进行统计分析。所有数据在分析前都进行正态性及方差齐性检验，对不符合整体分布的数据进行lg转化。AM真菌孢子组成根据每个孢子类型的数量进行相应计算。采用双因素方差分析检验模拟增温与不同植物对AM真菌孢子多样性的影响，不同处理间的显著性差异分析使用Post Hoc Test(Tukey法)在95%置信水平上进行检验。基于Bray-Curtis距离，对AM真菌的孢子群落进行主成分分析(Principal Co-ordinates Analysis,PCoA)，使用“vegan”程序包中的“adonis”函数(PERMANOVA)检验模拟增温与植物物种对AM真菌孢子组成的影响。

2 结果与分析

2.1 AM真菌孢子的形态鉴定

本研究共分离获得1 489个AM真菌孢子，按形态特征的不同可分成17种AM真菌形态种(图1)。这17个种分别属于8个属，其中球囊霉属(Glomus)6种，无梗囊霉属(Acaulospora)2种，巨囊霉属(Gigaspora)1种，盾巨囊霉属(Scutellospora)3种，平囊霉属(Pacispora)2种，内生囊霉属(Intraspora)1种，内养囊霉属(Entrophospira)1种和双孢囊霉属(Ambispora)1种。在数量方面，金黄球囊霉(Glomusaureum)的孢子数量最多(288个)，其次为Glomuscaesaris和浅窝无梗囊霉(Acaulosporalacunosa)，孢子数量分别为249个和170个。

图1 不同植物根际AM真菌种类

2.2 模拟增温及植物物种对AM真菌孢子的影响

模拟增温处理后，AM真菌孢子的丰富度并没有显著变化(图2)，但模拟增温显著降低了AM真菌孢子的密度(P<0.05)。AM真菌孢子丰富度及孢子密度在不同宿主植物物种间差异显著(P<0.05)。如图3所示，珠芽蓼根系AM真菌孢子的丰富度显著高于甘肃棘豆、线叶龙胆、麻花艽和金露梅根系AM真菌的孢子丰富度(图3)。此外，植物物种及增温处理的交互作用对AM真菌的孢子丰富度和密度均没有显著影响。在所调查的15种植物中，矮嵩草(F=13.71，P=0.004)和线叶龙胆(F=12.46，P=0.005)两个植物物种根际的AM真菌孢子密度在模拟增温后均显著降低(P<0.05)；但AM真菌的孢子丰富度在不同物种中都没有显著变化。

图2 AM真菌孢子丰富度(a)及密度(b)在不同处理间的差异

AM真菌孢子组成的PCoA分析和PERMANOVA结果表明：增温处理(F=1.26，R2=0.007，P=0.26)、植物物种(F=0.99，R2=0.08，P=0.52)及二者的交互作用(F=0.82，R2=0.07，P=0.90)均对AM真菌孢子组成无显著性影响(图4)。此外，在不同植物物种水平上，模拟增温同样也没有引起AM真菌孢子组成的显著变化。另一方面，本试验结果发现，AM真菌的孢子组成在不同植物物种间并没有显著性的差异(图5a)，但在不同植物科之间差异显著(F=2.02，R2=0.14，P=0.001，图5b)。

图4 不同处理下植物根际AM真菌孢子的PCoA分析

图5 不同宿主植物在物种(a)和科(b)水平上根际AM真菌孢子的群落组成

3 讨论

本研究在植物物种水平上探究了短期增温对根际AM真菌孢子组成的影响，研究结果将丰富我们对青藏高原AM真菌孢子多样性及其响应全球变暖的认识。研究结果共鉴定出17种AM真菌，分属8个属，孢子群落与青藏高原其他的研究结果类似。Gai等分别在莎草科植物的根际土壤和3种不同类型草地的根际土壤中检测出26[32]和23[33]种AM真菌。这些研究结果暗示了青藏高原这一环境独特的生态系统中具有较为丰富的AM真菌多样性。此外，我们发现美丽盾巨孢囊霉(Scutellosporacalospora)在这3个研究中均普遍存在，说明其可能是青藏高原的广布种。

温度升高往往可以增加植物根系的生物量[34]，促进植物分配给AM真菌更多的光合产物[35]，所以增温一般认为会对AM真菌的生长产生促进作用。然而本研究结果表明，在青藏高原高海拔地区，短期增温并不会增加AM真菌的孢子多样性，甚至还会降低AM真菌的孢子密度。依托分子鉴定技术的许多报道也证明模拟增温对植物根系内[24]或土壤中[26]的AM真菌多样性没有显著性影响。Hiiesalu等在2014年指出，AM真菌的多样性与植物的多样性呈正相关关系[36]，而本研究采用的是单植物物种的盆栽试验，植物物种的单一可能是AM真菌多样性较为稳定的原因。此外，有研究表明模拟增温并不会显著改变青藏高原植物的根系生物量或根冠比[37-38]，因此，稳定的AM真菌多样性也可能与植物对短期增温的不敏感相关。另一方面，本研究发现模拟增温会降低植物根际AM真菌的孢子数量，这与Yang等在2013年的试验结果并不一致，其研究表明4年的模拟增温并不会影响AM真菌的孢子密度[23]，这可能是由于植物物种组成的差异造成的，Yang等的试验是以自然草地为研究对象，而本研究则是以单物种的盆栽为研究对象。在植物物种水平上，本研究发现只有在矮嵩草和线叶龙胆两个物种水平上，模拟增温才显著降低AM真菌的孢子密度。这种植物物种间的差异或许与不同植物的生理特性相关，未来的研究需进一步探讨其具体的内在机理。在AM真菌物种水平上，本研究中AM真菌孢子密度的降低主要是由盾巨孢囊霉真菌孢子的丰度降低引起。王淼焱等在之前的研究中表明，盾巨孢囊霉真菌多分布于沿海等较为湿润的生态系统[39]，由增温所引起的土壤含水量降低可能不利于盾巨孢囊霉真菌的生长。

AM真菌群落组成受气候变化的影响在青藏高原生态系统中已被多次报道[23-26]。在本研究中，AM真菌群落结构并不受模拟增温的影响。一般认为，AM真菌的群落结构受宿主植物和土壤性质共同影响，在本研究中，稳定的植物生物量一定程度上解释了AM真菌群落结构的稳定性。另一方面，本研究发现宿主植物在科水平上对AM真菌孢子组成具有显著影响，但在植物物种水平上没有显著影响。AM真菌的宿主特异性已有较多报道[18-19]，而本研究表明，植物科的信息可以更精确地预测根际AM真菌的孢子组成。这一研究结果与石国玺等人的发现相吻合，其研究发现AM真菌侵染率在亲缘关系近的植物物种内并无差异，而在不同植物科之间存在显著差异[40]。这些研究结果支持Reinhart等的已有研究成果，表明目前已知的亲缘关系并不能准确地预测植物与AM真菌间的共生关系[41]，这可能与植物在科水平上的生态位分化与AM真菌的共生具有更强的相关性有关。

现有研究表明：土壤中AM真菌的孢子一直处于产生和萌发的动态过程中[42]，本研究对AM真菌的孢子采集处于植物生长季末期，虽然具有一定的代表性，但还需进一步在更多采样时间段进行相关研究，以期能够获取对AM真菌响应气候变暖的全面认识。此外，AM真菌虽然广泛分布于土壤中，但却具有不同的产孢能力，如无梗囊霉科和球囊霉科的AM真菌一般认为具有较强的产孢能力[43-44]。因此，以孢子形态鉴定为手段的方法未必能全面反映AM真菌对气候变暖的响应，未来研究需结合高通量测序等分子技术展开深入研究。

4 结论

综上所述，本研究结果表明，青藏高原不同宿主植物根际的AM真菌孢子组成在植物科水平上存在显著差异，模拟增温虽然对AM真菌孢子的多样性无显著影响，却显著降低了AM真菌的孢子密度，不利于特定AM真菌物种的生长。本研究结果系统分析了不同植物物种水平上AM真菌对模拟增温的响应，暗示了植物群落组成在影响AM真菌响应气候变暖中的重要性，为探究气候变暖下AM真菌的空间分布格局提供了生态依据。