急性应激障碍向创伤后应激障碍发展小鼠模型的制备

王子元，王 昊，黄 晏，周文霞

（1.南京中医药大学，江苏 南京 210023；2.军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所，抗毒药物与毒理学国家重点实验室，北京 100850）

应激障碍主要有急性应激障碍（acute stress disorder，ASD）和创伤后应激障碍（post-traumatic disorder，PTSD）［1］。二者的临床表现相似，均是严重的焦虑反应和对创伤线索的重度恐惧［2-3］；二者的主要区别在于症状持续时间，1个月内为ASD，超过1个月则为PTSD。早在17世纪，英国就有对PTSD症状的记载［4］，但直到越南战争后才引起人们的重视，并在由美国精神病学协会出版的《精神障碍诊断与统计手册》第Ⅲ版（Diagnostic and Statistical Manual for Mental Disorder，DSM-Ⅲ）中正式收录PTSD［5］。为了描述应激后短时间内部分人群出现的应激反应，并且确定急性创伤暴露患者中易发展为PTSD的高危人群［6］，DSM-Ⅳ第一次引入ASD的概念。在最新的DSM-Ⅴ中，进一步明确了PTSD和ASD的诊断要点并细化了诊断依据。

有多项研究表明，ASD对PTSD具有中等强度的预测效度，即超过半数的ASD患者最终会发展并被确诊为PTSD［7-12］。不过目前对于ASD发展为PTSD机制的了解并不透彻，临床中也缺乏有效的防治药物，仅有少部分研究显示，创伤暴露人群在应激后6 h内给予氢化可的松可以减轻ASD和PTSD的核心症状［13］。目前药物研究多采用单一的条件恐惧模型代表应激障碍模型［14-15］，这并不符合应激障碍的临床诊断标准。因此，需要基于多个行为学指标进行综合判定。现阶段多数应激障碍动物模型仅重点关注动物在PTSD阶段的生理状态变化［16-17］，建立一个采用多个行为学实验综合评价，观察从ASD向PTSD发展过程中生理状态变化的动物模型至关重要。

创伤经历是应激障碍发生的必要条件，在动物模型中，采用电击刺激模拟创伤经历具有易于精确调节应激强度和时程的优势。本研究通过小鼠连续3 d行足底电击模拟创伤经历，根据临床诊断依据，通过旷场实验、情景恐惧实验以及创伤线索回避实验模拟ASD和PTSD的焦虑样行为、再体验行为和主动回避行为。基于ASD和PTSD的诊断标准，以应激后前3 d模拟ASD，以应激后第28天模拟PTSD，观察小鼠行为学表现，通过行为特征分析筛选出不同时期的ASD或PTSD个体，以及不同阶段模型组小鼠的ASD和PTSD发生率，以期为ASD向PTSD的发展机制和防治药物研究提供可靠的动物模型。

1 材料与方法

1.1 动物和仪器

51只雄性SPF级C57BL/6J小鼠，体重20～24 g（北京斯贝福生物技术有限公司），动物许可证号：SCXK（京）2016-0002。饲养于军事科学院军事医学研究院实验动物中心，适应性饲养1周后用于实验。小鼠自由摄食饮水，每日光照/黑暗各12 h。动物实验室环境温度24～26℃，相对湿度40%～60%。动物饲养和所有实验方案均严格遵守军事科学院军事医学研究院实验动物伦理委员会的相关规定。

Anymaze动物视频分析系统，美国Stoelting公司；小鼠自主活动性实验装置（30 cm×30 cm×30 cm）上海吉量软件科技有限公司；Supermaze动物视频分析系统，小鼠旷场装置（40 cm×40 cm×40 cm）和电击箱（52 cm×30 cm×55 cm），上海欣软信息科技有限公司。

1.2 实验分组

剔除自主活动过高和过低的小鼠，具体方法为：实验前将动物置于实验房间，适应环境30～60 min；实验期间保持安静；采用Anymaze软件及视频采集系统记录每只小鼠在自主活动箱中20 min内自发活动总距离；每只小鼠实验完毕后，用50%乙醇擦拭箱体，避免气味干扰。以20 min内每只小鼠的活动总距离作为其自主活动性的指标，按照±s（95%置信区间）的标准，将运动距离超过此范围的小鼠剔除，然后按照体重和自主性活动半随机化分为正常对照组和模型组，每组25～26只。对每只小鼠进行编号。

1.3 足底电击制备应激模型

开始足底电击的第3天为时间轴的0天（图1）。小鼠结束适应性饲养后第1天（图1，-3 d）进行自主活动性实验，依据实验数据筛选小鼠后，将小鼠随机分为正常对照组和模型组。完成分组后第1天（图1，-2 d）对实验小鼠进行足底电击。足底电击强度依据文献进行微调［18］。实验前将动物置于实验房间，适应环境30 min到1 h；实验期间保持安静。电击箱中放入纯黑色物体A，作为创伤事件相关的线索。小鼠放入电击箱后适应5 min，之后给予模型组小鼠足底电击，强度为电流0.8 mA，每次持续10 s，间隔10 s，重复15次，连续电击3 d；正常对照组小鼠放入电击箱同等时间但不施加电击。应激后仍然保持一笼5～6只小鼠饲养。足底电击后第1～3天为急性期，依次进行旷场实验、创伤线索回避实验和情景恐惧实验。足底电击后第28～30天为慢性期，实验进行顺序同急性期。电击流程见图1。

Fig.1 Schedule of behavioral experiment.Mice were placed in the experimental room before the experiment and acclimated to the environment for 30 min to 1 h.A solid black object A was placed in the shock box as a cue related to the traumatic event.The mice were placed in the shock box and acclimatized for 5 min，after which the model mice were given foot shocks with a current of 0.8 mA，each lasting 10 s，at 10 s intervals，and repeated 15 times for 3 d（-2 d-0 d）.The normal control mice were placed in the shock box for the same amount of time but no electric shocks were applied.OFT：open field test；TCAT：traumatic cue avoidance test；CF：contextual fear test.

1.4 旷场实验检测焦虑样行为相关指标

在完成足底电击后的第1天和第28天进行实验，分别检测活动总距离（overall distance），中心区域运动时间（time in center），中心区域运动距离（distance in center）和中心区域进入次数（numbers of center entries）［19］。计算中心区域运动距离百分比，中心区域运动距离百分比（%）=中心区域运动距离/活动总距离×100%。实验时，将小鼠面壁放在实验箱一角，视频记录5 min内小鼠在旷场实验箱中的活动。旷场区域被等分为16格，其中中央4格定义为中心区，其余为外围区，实验时保证区域四角光线均匀。每只小鼠实验结束后均用50%乙醇擦拭箱底，以免气味干扰。

1.5 创伤线索回避实验检测小鼠探索物体的时间

在完成足底电击后第2天和第29天进行实验。本实验原理同埋球实验相似，利用小鼠对新物体具有探索欲望的特性，但是物体作为创伤线索引起小鼠的恐惧情绪会阻止小鼠对物体进行探索。先将作为创伤线索的纯黑色物体A放入自主活动性实验箱中（箱体中光强控制在30 lm），之后将小鼠贴壁放入实验箱中自由探索10 min，当小鼠面向物体，且鼻子主动嗅探物体或贴近物体周围2 cm范围即视为小鼠探索物体。记录小鼠探索物体的时间，以反映小鼠的主动回避行为。每只小鼠实验结束后，用50%乙醇擦拭箱体和物体，以消除前一只小鼠的气味干扰。

1.6 情景恐惧实验检测小鼠僵直时间［20］

在完成应激后第3天和第30天将小鼠重置电击箱中10 min。电击箱环境与小鼠应激时完全一致，但不施加电击刺激。记录小鼠僵直时间（除呼吸引起的极其微弱的起伏外，身体一动不动定义为僵直状态），以反映小鼠的再体验行为。

1.7 行为特征分析

在行为特征分析中，选取旷场实验中的中心区域运动距离百分比、创伤线索回避实验中的探索物体时间和情景恐惧实验中的僵直时间作为筛选指标。模型组小鼠的数据与正常对照组的数据进行比较。若中心区域运动距离百分比低于正常对照的（-1/2s）值，则表示小鼠出现焦虑样症状；探索物体时间或僵直时间高于正常对照组（+1/2s）值，则表示小鼠出现再体验症状或主动回避症状，当小鼠同时具有上述3个症状判定为ASD或PTSD小鼠［17］。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 足底电击对急性期和慢性期小鼠焦虑样行为的影响和行为特征分析

旷场实验结果表明，电击结束后第1天，与正常对照组相比，模型组（n=26）的总活动距离明显减少（P＜0.01）（图2A），中心区域运动时间（P＜0.01）（图2B）、中心区域进入次数（P＜0.01）（图2C）、中心区域运动距离（P＜0.01）（图2D）和中心区域运动距离百分比（P＜0.01）（图2E）显著降低，提示电击后第1天，即ASD阶段小鼠出现了焦虑样行为。至电击后第28天，与正常对照组（n=25）相比，模型组总运动距离明显减少（P＜0.05），提示探索行为异常未恢复；但其他指标均已无明显差异，提示电击后28 d，即PTSD阶段小鼠焦虑样行为已基本消失，说明提示随着时间的推移，小鼠的焦虑样行为逐渐消退。

将电击结束后第1天小鼠中心区域运动距离百分比进行升序排列，并与电击结束后第28天各小鼠相应指标进行对应（图2F）。结果显示，正常对照组（r=0.31，P=0.12）（图2G）小鼠在电击结束后第1天和电击结束后第28天中心区域运动距离百分比之间无明显相关性，模型组（r=-0.08，P=0.68）（图2H）不存在相关性。提示在ASD和PTSD阶段小鼠所表现的焦虑样行为无明显关联。

Fig.2 Effects of foot-shock on the related indexes of anxiety-like behavior in acute stress phase（the 1stday）and chronic stress phase（the 28thday）of mice by OFT.See Fig.1 for the legend.Percentage of distance in center（%）=distance in center/overall distance×100%.1stday threshold：（-1/2 s）of the normal control group′s percentage of distance in center（%）1 d after foot-shock；28thday threshold：（-1/2 s）of the normal control group′s percentage of distance in center（%）28 d after foot-shock.F：serial numbers from 1 to 25 were the mice of normal control group and 26-51 were the mice of model group.±s，n=25-26.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

行为学特征分析结果表明，正常对照组在电击结束后第1天和第28天均有7只焦虑样小鼠。模型组在电击结束后第1天有20只焦虑样小鼠，第28天减少到10只，其中有1只小鼠从无焦虑样症状发展为有症状，有12只小鼠从有焦虑样症状发展为无症状。

2.2 足底电击对急性期和慢性期小鼠物体的探索时间的影响和行为特征分析

创伤线索回避实验结果显示，足底电击结束后第2天，正常对照组小鼠物体的探索时间为（43±27）s，模型组为（20±21）s，明显降低（P＜0.01），提示产生明显的主动回避行为。电击结束后第29天，正常对照组小鼠物体的探索时间为（48±21）s，模型组为（17±19）s，明显降低（P＜0.01），提示回避行为依旧存在（图3A）。

将电击结束后第2天小鼠探索时间进行升序排列，并与应激后29天各小鼠相应指标进行对应（图3B），分析小鼠电击结束后第2天和第29天探索时间的相关性。结果显示，正常对照组小鼠（r=0.09，P=0.66）（图3C）电击结束后第1天的探索时间同第29天无明显相关性，而模型组小鼠（r=0.50，P＜0.01）（图3D）呈现中等强度的相关性，提示在ASD和PTSD阶段小鼠所表现的主动回避行为呈正相关。

Fig.3 Effects of foot-shock on the exploration time in acute stress phase（the 2ndday）and chronic stress phase（the 29thday）of mice by TCAT.See Fig.1 for the lengend.2ndday threshold：（-1/2 s）of the normal control group′s exploring time 2 d after foot-shock；29thday threshold：（-1/2 s）of the normal control group′s exploring time 29 d after foot-shock.±s，n=25-26.＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

行为学特征分析结果表明，正常对照组在电击结束后第2天和应激后第29天分别有8只和7只小鼠出现回避症状。模型组有19只小鼠在电击结束后第2天出现回避症状，在第29天上升到23只，其中4只从电击结束后第2天无回避症状发展到出现回避症状。

2.3 足底电击对急性期和慢性期小鼠僵直时间的影响和行为特征分析

情景恐惧实验结果显示，电击结束后第3天，正常对照组小鼠的僵直时间为（82±58）s，模型组为（202±82）s，明显升高（P＜0.01），提示产生明显的再体验症状。电击结束后第30天，正常对照组小鼠的僵直时间为（106±44）s，模型组为（142±71）s，明显升高（P＜0.05），提示再体验行为依旧存在（图4A）。

将应激后第3天小鼠僵直时间进行升序排列，并与应激后30 d各小鼠相应指标进行对应（图4B）。进而分析应激后第3天和第30天僵直时间的相关性，旨在了解小鼠再体验行为随时间推移的发展变化情况。结果显示对照组小鼠（r=0.11，P=0.59）（图4C）应激后第3天的探索时间同第30天无明显相关性，而模型组小鼠（r=0.72，P＜0.01）（图4D）呈现强相关性，提示在ASD和PTSD阶段小鼠所表现的再体验行为呈正相关。

行为学特征分析结果显示，正常对照组和模型组在应激后第3天分别有5只和24只小鼠出现再体验症状；在应激后第30天，对照组和模型组中出现再体验症状的小鼠数量分别为8只和14只。模型组中有10只小鼠从有再体验症状发展到无症状；无小鼠从无症状发展到出现症状。

2.4 小鼠ASD、PTSD发生率及ASD向PTSD发展分析

行为特征分析小鼠ASD和PTSD患病率结果显示，正常对照组小鼠（n=25）在急性期和慢性期的患病率分别为4.0%和8.0%。模型组小鼠（n=26）在急性期的患病率达到57.7%，随时间推移在30 d后下降到30.8%。应激后急性期有1只模型组小鼠仅出现一种症状，同时这只小鼠并没有发展为PTSD；模型组小鼠中有10只在急性期出现2种症状，其中有2只发展为PTSD；有15只模型组小鼠在急性期出现全部3种症状，即患有ASD，其中6只发展为PTSD。提示在应激初期患有ASD的小鼠可能更易发展为PTSD。

3 讨论

本研究结果显示，模型小鼠在急性应激期表现出明显的焦虑样行为，慢性应激期其焦虑样行为显著恢复，这种变化趋势与文献报道的应激动物模型和临床研究结果一致［22-23］。在情景恐惧和创伤线索回避方面，模型动物在急性期也表现出明显的情景恐惧和主动回避行为，且在慢性期无明显缓解，这也与已有研究的变化趋势一致［24-25］。在临床中，随着时间的推移创伤暴露患者症状的变化情况一直是研究的重点。通过相关性分析可以看出，应激后模型小鼠个体主动回避和再体验症状在急、慢性期的严重程度呈现较强的正相关性，而焦虑无明显相关性，说明应激后个体在急性期主动回避和再体验症状的严重程度可以预测慢性期症状的严重程度。作为创伤记忆的相关症状，个体在应激后急性期呈现出严重的主动回避或再体验症状会持续至慢性期、不易消退，这与创伤记忆难以消除是PTSD核心问题的现有主流理论相符［26］。这也提示对于应激障碍的临床干预，应该在创伤暴露后早期重点关注出现创伤记忆相关症状的患者，因为其症状长期持续的可能性更高。虽然，从整体上看模型动物在负性情绪、再体验症状以及主动回避等行为种均表现出一致的变化趋势并与已有研究结果一致，但是动物个体在暴露于应激事件后可呈现出不同程度的创伤反应［27-28］。所以，无法直接用群体平均值判定某一动物应激障碍的发病情况，要判定个体动物的发病情况需要对动物应激后个体行为指标进行分析。

目前，用于动物应激后个体行为学筛选的方法主要有2种：“cut-off behavioral criteria（CBC）”和“行为特征分析”。CBC是通过选择特定的标准来筛选行为学中表现极端的个体。如Cohen等［29］用高架十字迷宫和听觉惊跳反射2个行为学实验，选取开臂进入次数为0和平均惊吓幅度大于1200个单位作为CBC，同时符合2项标准的大鼠即为“适应不良”。结果显示，随着时间的推移，应激适应不良的患病率从应激后第1天的90%下降到7 d后的25%，并保持到应激后第30天不变。使用CBC进行筛选能够进一步提升模型的表观效度，但CBC的标准是应激群体中个体对应激反应的偏差，而临床诊断标准是基于正常人群的偏差［30］。为了更加接近临床的诊断，有多个研究者［17，31-32］对CBC法进行了改良，开发了一种新的筛选方法——行为特征分析。行为特征分析是将未应激的对照组的行为表现作为定义界限的基础，确定的截止标准应保证多数正常动物处于正常范围，然后基于截止标准对所有组别的动物进行分析，把偏离截止标准的动物定义为“患病”个体。此外，行为特征分析还需要同时采用多个行为学指标，被定义为行为学极端个体的动物需要在多个参数中均超过临界点，而不仅仅是一个参数。同时，行为特征分析的原则是以对照组作为筛选标准，使用此方法可以消除多次行为学实验本身对动物的影响。

行为特征分析结果显示，模型组小鼠急性应激期和慢性应激期的患病率分别约有57.7%和30.8%，这个患病率的时间序列特征与Bonanno等［32］使用CBC法后的发现类似，也同临床数据具有一致性。临床数据显示，在应激后被诊断为ASD的患者中有超过50%最终发展为PTSD，而在初期不符合ASD诊断依据的人群只有大约10%发展为PTSD［8］。在研究中，急性期同时符合3个ASD症状的15只小鼠中有6只在慢性期被诊断为PTSD，占比40%；急性期符合2个ASD症状的10只小鼠中只有2只发展为PTSD，占比20%；急性应激期符合1个ASD症状标准的只有1只小鼠，在慢性应激期没有被诊断为PTSD。本研究结果提示，应激后早期患有ASD的小鼠发展为PTSD的概率高于没有ASD的小鼠，这一现象也与临床数据相符。

综上所述，本研究成功建立了连续3 d足底电击致小鼠ASD向PTSD发展的模型。此模型较好地模拟了ASD和PTSD的临床症状、患病率和不同时期的状态变化，此模型有可能用于ASD向PTSD发病机制的研究和防治应激障碍的药物筛选评价。