金属铅和镉对副溶血弧菌生物被膜形成的影响

胡元庆,陈萍萍,李凤霞

（闽南师范大学生物科学与技术学院,福建漳州363000）

副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus）是一种革兰氏阴性的嗜盐性杆菌，广泛分布于近海岸的养殖环境、海底沉积物及各类海产品中，是海水养殖业的主要条件性致病菌，给水产养殖造成了巨大的经济损失[1].该菌也是最常见的食源性致病菌之一，近年来人类60%以上的食物中毒事件由其引发，患者常表现恶心、呕吐、腹痛和腹泻等症状[2].副溶血弧菌的致病性除了由溶血素TDH 和TRH、Ⅲ和Ⅳ型分泌系统及肠毒素等毒力因子决定，也与细菌生物被膜（biofilm，BF）的形成密切相关[3].

生物被膜是微生物为适应不良环境，粘附于非生物或活性组织表面，分泌大量的多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白和细胞外DNA，将菌体包裹而形成的菌体聚集膜样物[4].生物被膜作为一种特殊细菌群落，是细菌抵抗不利环境、产生耐药性并导致宿主持续性感染的重要方式[4-5].自然界中大部分细菌以多细胞形式存在，该群体结构可使细胞间相互协调而共生[5-6].组成生物被膜的细胞外基质（extracellular polymeric substances，EPS）将菌体包裹形成了一个物理屏障，大大增强了菌体对抗生素或其它有害化学物质的抵抗力[5,7].EPS 由许多不同的生物聚合物组成，它们将各自的物理特性传递给基质，从而为生物被膜提供强度、凝聚力和保留大小分子的能力[5].大量研究证实，几乎所有的细菌都可形成生物被膜结构，这也是食品加工环境中细菌持续存在的一个主要原因[7].细菌生物被膜引发的安全问题越来越多地被国内外学者所关注，严重威胁着人类的健康.

生物被膜对副溶血弧菌在环境中的持续存在和食物链中的传播起关键作用[8].副溶血弧菌为适应不利环境而形成生物被膜，其一旦生成就难以根除，从而引发潜在的食品安全风险[9].国内外关于食品中副溶血弧菌生物被膜的研究越来越多，已有学者研究了各种环境因子对该菌形成生物被膜的最佳条件[10-11]，以及多种防腐剂[12]、亚硝酸钠[13]、白藜芦醇等物质对该菌形成生物被膜的促进或抑制作用[14].关于金属离子对副溶血弧菌形成生物被膜影响的报道，主要研究了金属阳离子如Ca2+、Fe2+、Cu2+、Mg2+等对该菌生物被膜形成的影响[11].铅和镉是水体污染中常见的重金属，其对副溶血弧菌形成生物被膜的影响尚无报道.本文以副溶血弧菌ATCC17802 标准株为实验对象，研究铅和镉对该菌生物被膜形成的影响，可为有效控制副溶血弧菌形成生物被膜和治理水体污染提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌株：副溶血弧菌标准株ATCC17802，由漳州海关综合技术服务中心惠赠.

主要药品试剂：营养肉汤培养基、TCBS 选择性培养基，北京陆桥技术股份有限公司；硝酸铅、四水合硝酸镉、冰醋酸，阿拉丁控股有限公司；结晶紫，上海源叶生物科技有限公司；96孔聚苯乙稀U型细胞培养板，赛默飞世尔科技（中国）有限公司.

主要仪器设备：全波长酶标仪（MultiSkan Go），美国ThermoFisher 公司；紫外分光光度计（UV-1100），上海美普达仪器有限公司；隔水式恒温培养箱（GSP-9050MBE）、立式压力蒸汽灭菌器（BXM-30R），上海博迅实业有限公司医疗设备厂；超净工作台（SW-CJ-1FD），苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9030A），上海精宏实验设备有限公司；恒温振荡摇床（HQY-C），金坛市鸿科仪器厂；电子天平（AR124CN），奥豪斯仪器有限公司.

1.2 实验方法

1.2.1 菌悬液制备

副溶血弧菌标准株ATCC17802划线接种于TCBS培养基中，37 ℃培养24 h活化.挑取单菌落接种于3%NaCl营养肉汤中，37 ℃，200 r/min 振荡16～18 h，然后用含3%NaCl营养肉汤将菌液稀释至OD600=0.6备用.

1.2.2 生物被膜形成量

参照Djordjevic[15]等法并略做改进.将稀释好的菌液分别与含3% NaCl 营养肉汤按1∶3（v/v）混合均匀后，按每孔200 μL加至96孔细胞培养板中，每组3个平行，以无菌3%NaCl营养肉汤为空白对照.37 ℃培养72 h 后，弃去培养液，每孔用250 μL 生理盐水清洗两次，60 ℃干燥固定30 min.每孔用200 μL 的0.1%结晶紫溶液染色5 min 后弃去染液，生理盐水清洗3 次，60 ℃干燥10 min 后，每孔加200 μL 的33%冰醋酸作用5 min，酶标仪测定OD630值，比较不同浓度细菌的成膜情况.

1.2.3 培养温度与时间对生物被膜形成影响

将菌液与3%NaCl营养肉汤按1∶3体积混匀，每孔200 μL加至96孔细胞培养板中，静置培养，培养温度分别为4、28、37 ℃，培养时间分别为12、24、48、72、96 h，按1.2.2中的方法测定OD630值，比较不同培养温度和时间下的成膜情况.

1.2.4 重金属离子铅和镉对生物被膜形成影响

向培养基中添加硝酸铅和硝酸镉至不同的终浓度（0、50、250、450、650、850 μg/L），培养时间设为12、24、48、72、96 h，按1.2.2方法测定OD630值，分析两种离子对副溶血弧菌生物被膜形成的影响.

1.2.5 数据处理

采用GraphPad Prism 5.0 统计软件进行数据处理和作图，试验中指标测定均进行了3 次，图中用X±SD表示.

2 结果与分析

2.1 不同培养温度和时间对生物被膜形成影响

温度是生物被膜形成的重要影响因素.4 ℃是水产品低温贮运的温度，28 ℃是我国南方水产品生产季的环境温度，37 ℃是Vp 生长的最适温度，也是南方夏季的高温条件，本实验考查这三个温度对副溶血弧菌标准株ATCC17802 生物被膜形成的影响.由图1可知，三个不同温度条件下OD630值均逐渐增大，表明副溶血弧菌生物被膜的形成量随培养时间的延长而增加.4 ℃和28 ℃培养条件均在72 h 时OD630值达到最大，之后开始下降.37 ℃条件下48 h 时OD630值达到最大，之后开始下降.三个温度条件下的生物被膜形成总体呈先升后降趋势，符合生物被膜的形成规律，即开始小菌落慢慢成长，然后成为具有三维立体结构的成熟型生物被膜，之后部分细胞开始从生物被膜上脱落.在37 ℃条件下每个时间点测得的OD630值均最大，大约是28 ℃时OD630值的2 倍，生物被膜形成量最多，28 ℃时测得的OD630值比4 ℃时大.因此，37 ℃是副溶血弧菌生物被膜形成的最佳温度，28 ℃次之，随后的实验用37 ℃和28 ℃培养比较不同浓度Pb2+和Cd2+对Vp生物被膜形成影响.

图1 不同温度条件对副溶血弧菌生物被膜形成的影响Fig.1 Effects on biofilm formation of Vibrio parahemolyticus at different temperature

2.2 重金属离子对生物被膜形成的影响

2.2.1 结晶紫染色观察副溶血弧菌生物被膜的形成情况

37 ℃是副溶血弧菌生物被膜形成的最佳温度条件，观察此培养条件下Pb2+和Cd2+对生物被膜形成的影响.由图2可知（1～6 分别对应离子浓度是0、50、250、450、650、850 μg/L），细胞培养板中的细菌经结晶紫染色后，可观察到有生物被膜形成，并随着Pb2+和Cd2+浓度逐渐升高，生物被膜生成量逐渐下降，且呈梯度变化趋势.

图2 不同Pb2+和Cd2+浓度对副溶血弧菌生物被膜形成的影响Fig.2 Effects of different concentrations of lead and cadmium on biofilm formation of Vibrio parahaemolyticus

2.2.2 Pb2+对副溶血弧菌生物被膜形成的影响

本实验考查不同的硝酸铅终浓度（0、50、250、450、650、850 μg/L）对副溶血弧菌生物被膜形成的作用，不同的Pb2+浓度代表水环境的不同污染程度.由图3可知，在28 ℃时向培养基中添加不同浓度的Pb2+，随着培养时间的延长，OD630值呈先升后降的趋势，6个浓度条件均在72 h时OD630值达到最高.随着Pb2+浓度的增大，OD630值呈逐渐下降的趋势，表明Pb2+能抑制副溶血弧菌生物被膜的形成.由图4可知，在37 ℃时向培养基中添加Pb2+，随着培养时间的延长，OD630值呈先升后降趋势，6个浓度条件均在72 h时OD630值达到最高.随着Pb2+浓度的增大，OD630值呈逐渐下降的趋势，其中Pb2+浓度在50 μg/L和250 μg/L时，培养96 h的OD630低于48 h和72 h.从图3和图4可知，96 h培养组的生物被膜随着Pb2+浓度的升高，OD630下降最多，说明被抑制的程度也最高，这可能与该条件下生物被膜的结构不稳定有关.

图3 28 ℃时不同Pb2+浓度对副溶血弧菌生物被膜形成的影响Fig.3 Effects of different Pb2+concentrations on the biofilm formation of Vibrio parahaemolyticus at 28 ℃

图4 37 ℃时不同Pb2+浓度下副溶血弧菌生物被膜形成的影响Fig.4 Effects of different Pb2+concentrations on the biofilm formation of Vibrio parahaemolyticus at 37 ℃

2.2.3 Cd2+对副溶血性弧菌形成生物被膜的影响

本实验考查不同的Cd2+终浓度（0、50、250、450、650、850 μg/L）对副溶血弧菌生物被膜形成的作用，不同的终浓度代表水体中Cd2+不同的污染程度.由图5可知，在28 ℃时向培养基中添加Cd2+，随着培养时间的延长，OD630值呈先升后降的趋势，在72 h 时OD630值达到最高.随着Cd2+浓度的增大，OD630值呈逐渐下降的趋势，其中培养96 h 的OD630在Cd2+浓度为0～450 μg/L 范围时均低于24、48、72 h.由图6可知，在37 ℃时向培养基中添加Cd2+，随着培养时间的延长，OD630值呈先升后降的趋势，Cd2+浓度为0～450 μg/L范围组于72 h时OD630值达到最高.随着Cd2+浓度的增大，OD630值呈逐渐下降的趋势，其中培养96 h的OD630在Cd2+浓度为50～650 μg/L 范围时均低于24、48、72 h，这可能因为培养96 h 时生物被膜降解脱落，形成量减少.

图5 28 ℃时不同Cd2+浓度对副溶血弧菌生物被膜形成的影响Fig.5 Effects of different Cd2+concentrations on the biofilm formation of Vibrio parahaemolyticus at 28 ℃

图6 37 ℃时不同Cd2+浓度对副溶血弧菌生物被膜形成的影响Fig.6 Effects of different Cd2+concentrations on the biofilm formation of Vibrio parahaemolyticus at 37 ℃

3 讨论

温度和时间是影响生物被膜形成的重要参数[8,13].本研究首先分析了4、28、37 ℃对副溶血弧菌标准株ATCC17802 生物被膜形成的影响.结果表明在37 ℃条件下48 h 时生物被膜形成量达到最大，之后逐渐下降，与查飞等的研究结果一致[16].生物被膜的这种形成规律，主要因为细菌生物被膜的形成包括黏附、成熟和脱落3个阶段，起始阶段菌膜与固体介质的黏附能力较弱，随着菌膜成熟而形成稳定的生物被膜结构，然后胞外多糖分泌减少导致菌膜衰亡脱落[16].

沿海水域特别是海湾，已成为重要的海水养殖区域，同时也受到人类开发活动的干扰比较严重，尤其是重金属污染.杨妙峰[17]等于2019年对漳州东山湾海域养殖的贝类体内的重金属含量进行分析，发现华贵栉孔扇贝的Cd超标.黄玉英[18]等2020年分析了福州和泉州沿海养殖环境中贝类重金属污染状况，结果发现泉州的毛蚶中Cr含量超出限量值.微生物生活在富含重金属的环境中，通常会产生多种重金属抗性和解毒机制[19].而生物被膜的形成通常与微生物对金属的耐受性有关[20].假单胞菌产生的胞外多糖（EPS）对重金属的生物吸附或富集是细菌抗重金属特性的重要机制之一[19].微生物EPS对生物被膜和细胞聚集体的形成起着至关重要的作用，它有助于保护细胞免受恶劣环境的侵害，并能结合大量的重金属[21].生物被膜和浮游细胞对重金属的敏感性不同[22].研究表明，重金属的络合或固存作用以及阻止其在生物被膜中的扩散可能是保护细胞免受重金属毒性的重要原因[19].由于微生物EPS参与了溶液中重金属的絮凝和结合作用，因此其在生物修复过程中也具有特殊的意义[23].

副溶血弧菌已被认为是全世界食源性疾病的一个主要原因，它能够产生比其浮游形式更能抵抗消毒剂和抗生素的生物被膜[24].生物被膜的形成是一个复杂的动态过程，取决于细菌的性质和培养温度，而对于副溶血弧菌生物被膜的形成，这种相关性还不清楚[24].生物被膜的形成是食品工业的重要难题，因为这些生物被膜可能是交叉污染的来源，降低了食品的安全性[25].副溶血弧菌可以形成稳定的生物被膜，其生物被膜的形成与培养时间、温度、重金属铅和镉浓度有着密切的关系.本实验中副溶血弧菌形成生物被膜的最佳时间为72 h，最佳培养温度为37 ℃.培养基中添加Pb2+和Cd2+均会抑制副溶血弧菌形成生物被膜，添加的硝酸铅和硝酸镉浓度为50 μg/L时出现抑制作用，随着硝酸铅和硝酸镉浓度越高，测得的OD630值越小.本实验中得出副溶血弧菌生物被膜最佳培养温度是37 ℃，而梁宏雁等[11]的实验中最佳培养温度为28 ℃，所以在后续实验中同时比较在37 ℃和28 ℃条件下重金属对生物被膜形成的影响.硝酸铅对副溶血弧菌生物被膜起抑制作用，这可能是加入Pb2+的培养液具有亲水性，生物有机体分散生长.本实验中副溶血弧菌生物被膜形成量随着培养时间的延长呈现先上升后下降的趋势，72 h 处达到最大值，这符合细菌生物被膜的形成过程，在0至72 h里生物被膜逐渐生长到成熟，之后生物被膜降解，细胞脱落，生物被膜形成量下降.

总之，研究副溶血弧菌形成生物被膜的最佳时间和温度以及重金属铅和镉对其形成生物被膜的影响，确定水中Pb2+、Cd2+一定程度的污染是否会抑制副溶血弧菌形成生物被膜，可为深入研究重金属对该菌形成生物被膜的作用奠定基础，也为有效控制该菌形成生物被膜提供参考.