lncRNA FAM27L对喉癌TU212细胞增殖和侵袭的影响及其分子机制

张 杨 范崇盛 郭 洁 赵 丹 魏珍星

喉癌在呼吸道恶性肿瘤中的发生率居第2位，是最常见的头颈恶性肿瘤之一[1]。目前，喉癌发生率在多数国家均呈上升趋势，吸烟、空气污染、酒精等可能是喉癌的致病因素[2]。尽管外科手术方式、化疗药物和放射治疗手段均得到很大的发展，喉癌患者的总体生存率仍然较低[3]。喉癌在分子水平的发病机制尚未明确，寻找新的分子治疗靶点对提高喉癌患者生存率显得尤为迫切。长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度>200nt的内源性RNA分子，不能编码蛋白，主要通过调控基因组印记、核内运输、转录激活等方式影响基因的表达[4]。lncRNA在鼻咽癌、食管癌、甲状腺癌等多种肿瘤中的表达呈异常改变，其作用类似于抑癌基因或癌基因，参与肿瘤的发生、发展，在肿瘤的早期诊断、治疗和预后等方面可能具有潜在的临床价值[5, 6]。FAM27L全长682nt，已被证实在卵巢癌组织中呈低表达，FAM27L表达水平较高的患者总体生存时间较长，FAM27L可作为卵巢癌患者的独立预后因素[7]。FAM27L在喉癌中作用的研究尚未见报道，本研究通过对喉癌组织和细胞系的研究，探讨FAM27L对喉癌细胞增殖和侵袭的影响及其分子机制。

材料与方法

1.组织标本：收集2018年2月～2020年10月在笔者医院行喉癌手术的35例患者的癌组织和癌旁组织标本，所有组织均在离体后立即置于液氮保存，所有癌组织均经病理学检查为喉癌组织，癌旁组织未见癌细胞。患者年龄51～68岁，平均年龄为57.14±7.72岁。低分化5例，中高分化30例。Ⅰ～Ⅱ期共15例，Ⅲ～Ⅳ期共25例。声门型23例，声门上型+声门下型12例。所有患者术前均未行放疗、化疗等辅助治疗。该研究通过笔者医院医学伦理学委员会的批准，患者均签署知情同意书。

2.细胞系与主要试剂：喉癌细胞系(AMC-NH-8、TU177、Hep-2、TU212、TU686)和人支气管上皮细胞(16HBE)购自中国典型培养物保藏中心。阴性对照质粒和FAM27L过表达质粒购自上海吉玛制药技术有限公司。qPCR试剂盒购自瑞士Roche公司。四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂盒购自美国Sigma公司。DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司。Transwell小室购自美国Corning公司。LipofectamineTM2000和Trizol试剂购自美国Invitrogen公司。RPL41、GAPDH、p-JNK、p-ERK、p-mTOR蛋白抗体购自美国CST公司。Matrigel基质胶购自美国BD公司。

3.细胞培养与转染：喉癌细胞系(AMC-NH-8、TU177、Hep-2、TU212、TU686)和人支气管上皮细胞(16HBE)采用DMEM(含10%胎牛血清)培养基常规培养，在37℃、5% CO2培养箱中培养。调整对数生长期的TU212细胞密度，接种于6孔板，过夜培养后，根据LipofectamineTM2000说明书分别将阴性对照质粒和FAM27L过表达质粒转染至细胞，将细胞分为阴性对照组和FAM27L组。

4.qPCR检测组织和细胞中FAM27L、miR-744-3p和RPL41 mRNA的表达：采用Trizol法提取组织匀浆及细胞总RNA并反转录，根据SYBR Premix Ex Taq试剂盒说明书制备qPCR反应体系，反应参数为96℃ 15 min、95℃ 10 s、62℃ 40s、72℃ 40s，35个循环。GAPDH作为内参检测FAM27L和RPL41 mRNA的表达，U6作为内参检测miR-744-3p的表达。相对表达量以2-ΔΔCt法进行计算，qPCR引物详见表1。

表1 检测FAM27L、miR-744-3p和RPL41 mRNA表达的qPCR引物序列

5.MTT法检测TU212细胞增殖能力：将两组稳定转染细胞按照每孔2×103个细胞铺至96孔板，在培养箱内连续培养5天，每天进行MTT法测量，每孔加入MTT溶液10μl，在培养箱内避光培养4h，弃掉孔内培养基，每孔加入DMSO溶液100μl，于摇床快速振荡10min，保证结晶物充分溶解，将96孔板置于酶标仪检测450nm波长处的吸光度(A)值，绘制TU212细胞生长曲线。

6.Transwell实验检测TU212细胞侵袭能力：将30μl Matrigel基质胶均匀铺于Transwell小室，在培养箱中凝固。实验前12h更换两组细胞培养基为无血清培养基。将600μl完全培养基加入24孔培养板。消化两组细胞并清洗3遍，细胞重悬并计数，加入200μl细胞悬液至Transwell小室，消除气泡。培养箱内培养24h，取出Transwell小室，甲醇固定，0.1%结晶紫染液进行染色，流水清洗后采用棉签擦拭Transwell小室内部，在倒置显微镜下计数穿过膜的细胞数。

7.生物信息学网站预测FAM27L互补结合的基因和位点：按照LncBase Predicted V.2网站预测FAM27L可互补结合的miRNA，使用miRWalk2.0网站预测miRNA可互补结合的靶基因。

8.Western blot法检测RPL41及MAPK信号通路蛋白的表达：将转染后48h的两组TU212细胞，加入细胞裂解液裂解35min，收集上清并检测蛋白浓度。蛋白变性后，每组加30μg蛋白至聚丙烯酰氨凝胶(5%浓缩胶，10%分离胶)，电泳后转膜，采用5%脱脂奶粉封闭，加入一抗GAPDH(1∶3000稀释)、RPL41(1∶1000稀释)、p-JNK(1∶500稀释)、p-ERK(1∶1000稀释)、p-mTOR(1∶500稀释)4℃孵育过夜。TBST溶液洗膜后，加入二抗孵育2h，滴加ECL发光试剂，采用凝胶成像系统拍照。

结 果

1.FAM27L在喉癌组织和癌旁组织中的表达：qPCR检测结果显示，与癌旁组织比较，FAM27L在喉癌组织中表达下调(图1，P<0.01)。

图1 FAM27L在喉癌组织和癌旁组织中的表达

2.FAM27L在人支气管上皮细胞和喉癌细胞系的表达：qPCR检测结果(图2)显示，FAM27L在喉癌细胞系(AMC-NH-8、TU177、Hep-2、TU212、TU686)中的表达明显低于人支气管上皮16HBE细胞(P<0.05或P<0.01)，其中在TU212细胞中表达量最低(P<0.01)，故选择TU212细胞进行后续实验。

图2 FAM27L在人支气管上皮细胞和喉癌细胞系中的表达与16HBE细胞比较，*P<0.05，**P<0.01

3.转染FAM27L过表达质粒明显促进TU212细胞FAM27L的表达：qPCR检测结果显示，阴性对照组和FAM27L组TU212细胞中FAM27L表达量分别为1.03±0.13和12.55±1.39(P<0.01)，成功构建FAM27L过表达细胞系。

4.过表达FAM27L可抑制TU212细胞的增殖能力：MTT实验检测结果显示，与阴性对照组比较，过表达FAM27L后FAM27L组的TU212细胞增殖能力从第2天开始明显降低(图3，P<0.05或P<0.01)。

图3 过表达FAM27L对喉癌细胞TU212增殖能力的影响与阴性对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

5.过表达FAM27L可抑制TU212细胞的侵袭能力：Transwell实验检测结果(图4)显示，阴性对照组和FAM27L组TU212细胞穿过膜的细胞数分别为95.14±8.82个和44.12±8.92个(P<0.01)。

图4 过表达FAM27L对喉癌细胞TU212侵袭能力的影响A.穿膜细胞结晶紫染色(×100)；B.穿膜细胞数统计分析

6.生物信息学预测：采用LncBase Predicted V.2预测结果显示，FAM27L可与miR-744-3p互补结合，miRWalk2.0预测预测结果显示，miR-744-3p与RPL41 mRNA存在靶向结合位点(图5)。

图5 生物信息学方法预测FAM27L互补结合的基因和位点A.FAM27L与miR-744-3p互补结合的位点;B.miR-744-3p与RPL41 mRNA互补结合的位点

7.过表达FAM27L可调控miR-744-3p、RPL41 mRNA的表达：阴性对照组和FAM27L组TU212细胞中miR-744-3p表达量分别为1.01±0.08和0.24±0.07(P<0.01)。与阴性对照组比较，FAM27L组细胞中miR-744-3p的表达降低。阴性对照组和FAM27L组TU212细胞中RPL41 mRNA表达量分别为1.02±0.07和7.38±1.01(P<0.01)。与阴性对照组比较，FAM27L组细胞中RPL41 mRNA的表达增加。

8.过表达FAM27L对RPL41蛋白及MAPK信号通路蛋白表达的影响：Western blot法检测结果显示，与阴性对照组比较，转染FAM27L后，RPL41蛋白表达增加，MAPK信号通路蛋白p-JNK、p-ERK、p-mTOR表达降低(图6)。

图6 Western blot法检测 FAM27L对RPL41蛋白表达的影响

讨 论

长链非编码RNA(lncRNA)参与调控肿瘤细胞分化、增殖、凋亡、侵袭、迁移等生命活动，在肿瘤血管生长、化疗敏感度、放疗敏感度等方面扮演重要角色，与肿瘤的发生、发展及患者的预后密切相关[8, 9]。研究显示，部分lncRNA在喉癌中的表达异常改变，可能成为喉癌的生物学标志物和分子治疗靶标[10]。Liu等[11]研究证实，喉癌组织中SNHG1的表达高于癌旁组织，SNHG1表达水平与病理分期、淋巴结转移呈正相关，SNHG1表达水平高的患者的总生存期较差，敲除SNHG1可导致喉癌细胞的活力和增殖能力下降。Tang等[12]研究表明，沉默DGCR5表达可抑制喉癌细胞的肿瘤干性，增强其对放射治疗的敏感度。研究表明，FAM27L的功能类似抑癌基因，与卵巢癌的预后显著相关[7]。本研究发现，在喉癌组织中FAM27L表达水平明显低于癌旁组织，在喉癌细胞系中FAM27L表达水平明显低于人支气管上皮细胞，表明FAM27L可能在喉癌的发生、发展中发挥重要作用。通过进一步构建FAM27L过表达细胞系，MTT实验和Transwell实验结果显示，过表达FAM27L后，TU212细胞的增殖和侵袭能力均明显降低。

miRNA是lncRNA发挥作用的重要一环，lncRNA通过碱基不完全配对方式与miRNA互补结合，下调miRNA的表达[13]。本研究应用LncBase Predicted V.2数据库预测FAM27L可与miR-744-3p互补结合。Li等[14]研究发现，miR-744-3p在喉癌细胞系中表达上调，miR-744-3p表达水平与喉癌的淋巴结转移呈正相关，沉默miR-744-3p表达可抑制喉癌细胞的迁移和侵袭，提示miR-744-3p作为癌基因促进喉癌的进展。本研究结果显示，过表达FAM27L后TU212细胞中miR-744-3p表达下调，提示FAM27L抑制TU212细胞增殖和侵袭作用可能与下调miR-744-3p的表达有关。miRNA主要通过与靶基因mRNA互补结合，降解靶基因mRNA或直接抑制其翻译为蛋白，从而靶基因的表达[15]。本研究应用miRWalk2.0数据库预测miR-744-3p可与核糖体蛋白L41(ribosomal protein L41，RPL41)mRNA互补结合。RPL41属于核糖体蛋白家族，是由25个氨基酸组成的小分子多肽[16]。研究显示，RPL41在多种肿瘤如肝癌、胆管癌、宫颈癌中表达缺失或降低，提示RPL41可能具有肿瘤抑制作用，RPL41是一种抑癌基因[17]。本研究显示，miR-744-3p表达下调后，RPL41 mRNA的表达增加。MAPK信号通路对喉癌细胞增殖和侵袭起到明显的促进作用[18]。RPL41蛋白表达增加后，MAPK信号通路蛋白p-JNK、p-ERK、p-mTOR表达明显降低，提示MAPK信号通路转导被干扰。

综上所述，FAM27L在喉癌组织和细胞系中低表达，高表达FAM27L可能通过下调miR-744-3p的表达，促进RPL41基因的表达，干扰MAPK信号通路转导，从而抑制喉癌细胞的增殖和侵袭。本研究可能为以FAM27L为靶点的基因治疗提供一定的理论和实验基础。