响应面法优化绿萝花多酚超临界CO2萃取工艺

董新艳，高文懿，阮玺如，吴志革，赵世淳

(浙大宁波理工学院 生物与化学工程学院，浙江 宁波 315100)

绿萝花是瑞香科、结香属的植物滇结香的花蕾[1]。据文献报道，目前绿萝花中已经检出多酚、多糖、脂肪酸等多种化合物[2-7]。现代药理学研究结果证实绿萝花作为一种名贵藏药材具有治疗糖尿病、冠心病、高血压等功效[8-9]，这可能由于其富含多酚化合物[2，10]。目前，有关绿萝花的研究报道仅限于挥发油、还原糖的提取分离及其抗氧化、降血糖等药理作用及机制研究[11-12]，尚未有绿萝花中多酚的超临界提取工艺的相关报道。本文在单因素实验的基础上，采用响应面设计对绿萝花中多酚的超临界提取工艺进行优化，旨在为绿萝花作为功能性食品及药物的进一步开发提供理论科学依据。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

绿萝花，购自青海优草商贸有限公司；没食子酸标准品(纯度≥89.9%)，中国食品药品检定研究院；Folin Ciocalteu试剂(2N)，上海荔达生物科技有限公司；无水乙醇、无水Na2CO3均为分析纯，；高纯CO2(纯度≥99%)。

Spe-ed SFE-Z 2402AC型超临界流体萃取仪；752PC紫外可见分光光度计；FA2004电子天平。

1.2 实验方法

将干燥后的绿萝花蕾粉粹成粉末，过4号筛(65目)。称取绿萝花粉末0.7 g，装入不锈钢萃取柱中，将萃取柱接入超临界流体萃取仪的气体管路，调节温度为50 ℃和压力为30 MPa，使得萃取流体处于超临界状态，调节夹带剂的流速0.4 mL/min，动态萃取2 h。

1.3 分析方法

1.3.1 标准曲线的绘制 配制浓度为0.146 mg/mL的没食子酸标准溶液，分别移取2.5，3，4.5，7，8.5，10 mL没食子酸标准溶液于10 mL棕色容量瓶中，用去离子水定容。分别移取不同浓度没食子酸溶液1 mL于25 mL棕色容量瓶中，分别加入2 mL福林酚原液，静止 8 min 后，再各加入 6 mL 7.5% Na2CO3溶液，用去离子水定容至25 mL，摇匀后静置于25 ℃恒温槽中进行显色反应2 h，于波长760 nm下测量其吸光度。以吸光度值和没食子酸浓度为横纵坐标，绘制标准曲线为：Y=5.789 96X-0.057 32(R=0.999 58)。

1.3.2 绿萝花中多酚得率的测定 超临界萃取结束后，将接收瓶中的提取液进行旋蒸，并用80%乙醇定容于25 mL容量瓶中，从中移取3～10 mL于棕色容量瓶中，用去离子水定容。取1 mL稀释后的样品溶液至25 mL的棕色容量瓶中，按1.3.1节采用Folin-Ciocalteu[13]比色法测定多酚含量，并根据标准曲线计算多酚得率。

式中C——通过标准曲线计算得出的多酚浓度，mg/mL；

m——称取的花的质量，g。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 乙醇夹带剂的浓度对多酚得率的影响 以乙醇水溶液为夹带剂，提取压力为30 MPa，萃取温度为50 ℃，萃取时间为2 h，夹带剂流速为0.4 mL/min，考察夹带剂(乙醇水溶液)中乙醇的体积分率对绿萝花中多酚萃取得率的影响，结果见图1。

由图1可知，夹带剂(乙醇水溶液)中乙醇的体积分率升高，多酚得率先增加再减小，在乙醇浓度为70%时，多酚得率出现峰值。这主要是由于多酚类物质均含有酚羟基，具有一定的极性。萃取溶剂的极性过大或者过小均对多酚得率具有一定的影响。当夹带剂中乙醇浓度过低时，含水量大，造成萃取溶剂的极性过大；当乙醇浓度过高时，萃取溶剂的极性又过小，因此高乙醇浓度及低乙醇浓度的夹带剂均不能将一定极性的多酚全部萃取出来，造成多酚得率较低。含70%乙醇的夹带剂，极性更为适中，对具有特定极性的多酚具有较高的提取效率。

图1 乙醇浓度对多酚得率的影响

2.1.2 萃取压力对多酚得率的影响 萃取温度为50 ℃，萃取时间为2 h，以70%乙醇(体积分数)的水溶液为夹带剂，夹带剂流速为0.4 mL/min，考察萃取压力对绿萝花中多酚萃取得率的影响，结果见图2。

图2 萃取压力对多酚得率的影响

由图2可知，多酚得率随着萃取压力的增大而增加，这是由于超临界流体的密度随着压力的增加而增加，尤其是在低压段，密度随压力的变化更为敏感[13]。因此，超临界流体的溶剂化能力也随密度增加而增强，对多酚的溶解能力也增大，从而多酚得率增加。此外，过高的压力对设备的要求更高，动力消耗更大。因此，萃取压力以30 MPa左右为宜。

2.1.3 萃取温度对多酚得率的影响 提取压力为30 MPa，萃取时间为2 h，以70%乙醇(体积分数)的水溶液为夹带剂，夹带剂流速为0.4 mL/min，考察萃取温度对绿萝花中多酚萃取得率的影响，结果见图3。

图3 萃取温度对多酚得率的影响

由图3可知，温度上升，多酚得率先上升，>50 ℃时又下降。这主要是由于温度对萃取效果具有双重影响：首先，随着温度升高，超临界流体的扩散系数与溶质的挥发性增加，使得溶质与溶剂间的传质效率增强，对溶质的溶解萃取有正影响；另一方面，随着温度增加，超临界流体密度下降，对溶质的溶解萃取有不利影响。因此，50 ℃为较适宜的萃取温度。

2.1.4 萃取时间对多酚得率的影响 提取压力为30 MPa，萃取温度50 ℃、70%乙醇(体积分数)的水溶液为夹带剂，夹带剂流速为0.4 mL/min，考察萃取时间对绿萝花中多酚萃取得率的影响，结果见图4。

图4 萃取时间对多酚得率的影响

由图4可知，多酚得率随着萃取时间的增大而增大，这主要是由于多酚在超临界流体中溶解随着时间增加而更加充分。然而，萃取时间若长于2 h后，由于多酚在萃取剂中溶解达到平衡，造成多酚的得率缓慢增加。而当萃取时间超过2.5 h，多酚得率略有下降，这可能是由于萃取时间过长，多酚类物质氧化或分解。综合考虑，选择提取时间为2 h。

2.2 响应面优化实验

在单因素实验的基础上，选择萃取压力、萃取温度、夹带剂乙醇浓度为实验因素，以多酚萃取得率为评价指标，设计了3因素3水平的Box-Behnken响应面实验，因素水平见表1。

表1 响应面因素水平表

2.2.1 模型建立及模型方差分析 响应面的设计与结果见表2，为了估计实验误差，本次实验中共进行了5次中心实验。采用Design expertV 8.06 软件对表2的实验数据进行多元回归拟合，得到萃取压力(A)、萃取温度(B)、夹带剂浓度(C)与多酚得率间的二次多项回归模型为：Y=-84.102 94+0.392 35A+1.820 28B+1.307 75C-4×10-5AB-4.862 5×10-4AC+1.223 75×10-3BC-6.4×10-3A2-0.018 865B2-0.010 112C2，方差分析见表3。

表2 响应面实验设计与结果

表3 回归模型方差分析

2.2.2 多酚得率的响应曲面分析 根据拟合模型，利用Design expert软件绘制交互因子的响应面及其等高线图，见图5～图7，显示了萃取压力(A)、萃取温度(B)、夹带剂浓度(C)中任意一个变量取零水平时，其余两个变量对多酚得率的影响。

图5 萃取压力和萃取温度对多酚得率的影响

图6 萃取压力和乙醇浓度对多酚得率的影响

图7 萃取温度和乙醇浓度对多酚得率的影响

图5为当采用含70%乙醇(体积分率)的乙醇水溶液为夹带剂时，萃取压力和萃取温度对绿萝花中多酚萃取得率的影响。

当萃取温度一定时，多酚得率随着萃取压力的增加而增加；而当萃取压力一定时，随着萃取温度变化，多酚得率先增加后减小。这说明响应面的最高点，即等高线中最小椭圆的中心点为实验范围的最大值。

图6为当萃取温度为50 ℃时，萃取压力和乙醇浓度对多酚得率的影响。

当乙醇浓度一定时，多酚得率同样随着萃取压力的增加而增加；当萃取压力一定时，随着乙醇浓度的增加，多酚得率先增加后减小。同时可以看出，多酚得率随着乙醇浓度的变化幅度明显高于随萃取压力的变化幅度。此外，从等高线图也可以看出，沿乙醇浓度轴的等高线密度变化相对沿压力轴的变化大。以上均可说明夹带剂浓度对多酚得率的影响比压力显著，与方差分析结果相符合。

图7为当萃取压力为20 MPa时，萃取温度和乙醇浓度对多酚得率的影响。当乙醇浓度一定时，随萃取温度的变化，多酚得率先增后减，变化趋势较平缓；当萃取温度一定时，多酚先增加后减小，变化幅度陡峭，说明夹带剂浓度的主效应大于萃取温度，与方差分析结果相符合。同时，观察其等高线图，沿乙醇浓度轴向等高线密集，而沿萃取温度轴等高线相对稀疏，同样说明夹带剂浓度对多酚得率的影响高于萃取温度。

2.2.3 最佳工艺条件的预测及实验验证 运用Design expert软件对绿萝花多酚得率二次多项回归模型进行最优化求解，得到最优最佳工艺条件为：萃取压力为27.94 MPa、萃取温度为50.39 ℃、夹带剂为含67.4%乙醇(体积分率)的乙醇水溶液。在此条件下，多酚理论得率为11.077 8 mg/g。为便于实验操作，将各条件调整为萃取压力为28 MPa，萃取温度为50.4 ℃，夹带剂为67%乙醇(体积分率)的乙醇水溶液，在此条件下进行验证，测得绿萝花中多酚得率为(11.015±0.15)mg/g，与理论值相比误差仅为0.56%，说明该模型拟合度较高、有效可行。

3 结论

超临界CO2萃取绿萝花中多酚的最佳工艺条件为：萃取压力为28 MPa，萃取温度为50.4 ℃，夹带剂为67%乙醇(体积分率)的水溶液。在此条件下，多酚得率达(11.015±0.15)mg/g，与理论值误差0.56%。