发酵棉粕的工艺研究及其在动物生产中的应用

■宣秋希 乔 琳 侯晓林 李爱科 王永伟 王薇薇 段 涛 罗 鹏

（1.国家粮食和物资储备局科学研究院粮食品质营养研究所，北京 100037；2. 北京农学院动物科学技术学院，北京 102206）

近年来，我国养殖业在不断的发展和进步，养殖群体也在不断的扩大和优化，其中动物饲粮被重点关注。豆粕（SBM）因其较高的营养价值和良好的氨基酸组成，超过85%被用作动物饲养首选的蛋白质原料[1-2]。据报道，仅依靠豆粕所含的氨基酸就可满足家禽和猪对营养的需求[2]。但蛋白质资源短缺是我国养殖业面临的重要问题之一，调查显示，我国大豆产需缺口随国内消费结构升级而不断扩大，虽然2020 年国内大豆产量达到1 882 万吨，但无法满足对饲用豆粕需求量的增加，仍需大量依赖进口[3]。解决资源短缺的出路在于开源节流，我国是产棉大国，棉籽粕（CSM）资源丰富，含有较高的粗蛋白质和丰富的氨基酸等物质，是一种极具开发潜力的可替代豆粕的植物蛋白质饲料资源[4-7]。但因棉粕中含有一些以游离棉酚为主的抗营养因子，对动物有害，限制了棉粕在饲料上的应用，造成蛋白质资源的浪费[8]。为了克服这些不利因素，国内外就棉粕脱酚的办法做了许多研究，其中利用益生菌固态发酵给棉粕脱毒并提高棉粕营养价值引起研究者们的广泛关注[9]。

1 发酵棉粕的微生物选择

目前，美国食品药物管理局（FDA）和美国饲料认定协会（AAFCO）公布43 种益生菌可进行饲料发酵，2013 年我国农业部发布的《饲料添加剂品种目录》中公布了34种菌可用于养殖动物饲料发酵及饲料添加剂，且在发酵工艺中，菌种的选择直接影响发酵饲料的品质，因此，应严格按照菌种安全、无杂菌、繁殖能力快、成本低廉、发酵效果优良等条件挑选优质菌种[10]。近年来研究较多的菌种包括：乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌等。

1.1 乳酸菌

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的统称。乳酸菌是革兰氏阳性菌，无芽孢，形态可分为杆菌和球菌，属于厌氧细菌或者兼性厌氧细菌，能在液体培养基上快速且大量繁殖[11]。乳酸菌无毒无害、无致病性、无致癌性，已被广泛用于生产各种食品和饲料原料[12]。有研究显示，乳酸菌通过发酵利用饲料原料中的碳水化合物进行生长代谢，成为优势菌群，其主要作用有：①产生大量乳酸等有机酸（乙酸等挥发性脂肪酸），降低饲料pH[13-14]，抑制有害菌的生长，防止饲料发生腐败与霉变；②可产生明显酸香味，改善饲料的风味和质地[15]，提高适口性；③提高饲料原料中的某些营养物质，如多肽、B 族维生素、游离氨基酸等[16]；④分解饲料原料中某些不易被吸收的大分子物质或抗营养因子，如豆粕中大分子蛋白被降解成可吸收的小分子肽[17]、棉粕中游离棉酚的脱除[18]等。

1.2 芽孢杆菌

芽孢杆菌属（Bacillus）是一类能够生成内生孢子的杆状细菌属，属于好氧或兼性厌氧的革兰氏阳性菌，在自然界中广泛存在，繁殖能力强，生活条件简单且具备稳定性好、耐受多种不利条件、抗逆性强等生理特点。芽孢杆菌在发酵过程中产生大量活性物质，如淀粉酶、蛋白酶、少量脂肪酶、纤维素酶等多种酶类，将饲料原料中不易被吸收的植源性物质分解成小分子肽和游离氨基酸[19]，降低饲料中纤维素和半纤维素的含量[20]。同时芽孢杆菌在降解毒素和抗营养因子方面的应用效果较好，试验证实枯草芽孢杆菌对黄曲霉毒素B1[21-22]、游离棉酚[23-24]的降解率较高。若芽孢杆菌与乳酸菌协同发酵，芽孢杆菌可在发酵过程中消耗大量氧气，形成厌氧环境，一方面能促进乳酸菌的增殖，另一方面可抑制其他好氧有害菌的生长[25]。因此很多研究者将芽孢杆菌作为常用发酵菌剂广泛地应用于发酵饲料中。

1.3 酵母菌

酵母菌（Saccharomycetes）是一种真核微生物，属于子囊菌亚门、是单细胞真菌，以芽殖或裂殖方式繁殖，且酵母菌属于兼性厌氧菌，在饲料前期发酵过程中进行有氧代谢，产生大量的CO2，创造厌氧条件，复合发酵时有利于乳酸菌增殖代谢[26]，后期进行无氧发酵，将葡萄糖分解成乙醇和CO2。同时酵母菌含有丰富的蛋白质、氨基酸、B 族维生素等丰富的生物活性物质，无毒无害又繁殖迅速，因此使用酵母菌作为饲料的发酵菌剂已成为发酵饲料研究的新热点[27]。罗远琴等[28]和Long 等[29]发现，通过利用酵母菌发酵棉粕、豆粕等饲料可使其中的乙醇含量显著增加，可以软化饲料并产生醇香味，与枯草芽孢杆菌共同发酵可以明显改善饲料因枯草芽孢杆菌发酵产生的枯草腐败味，提高饲料适口性。酵母菌在发酵过程中，不但可以利用发酵底物作为碳源自身合成菌体蛋白[30]，还可以将饲料中的非蛋白氮进行转化[31]，将其中的纤维素类物质充分转化为高附加值的单细胞蛋白。此外，酵母菌可在固态发酵下实现玉米黄曲霉毒素、棉粕游离棉酚等的生物脱毒[32]，具有良好的应用效果。

2 发酵棉粕的工艺条件优化

目前，发酵棉粕通常采取固态发酵作为发酵方式，多数研究表明[33-40]，适宜的发酵条件对棉粕固态发酵过程中的益生菌菌种生长、代谢产物和饲料的营养成分都有很大的影响，且针对不同菌种和发酵底物的发酵条件也不尽相同。研究者们通过对发酵时间、温度、初始含水量、菌种接种量和接种比例等发酵条件进行优化，确定棉粕的最适发酵条件，使得棉粕的发酵效果达到最优，关于固态发酵棉粕工艺优化的条件见表1。

表1 不同发酵工艺条件对棉粕发酵的影响

通过研究者们大量的研究可以总结得出，益生菌固态发酵棉粕的最佳发酵时间范围为48～72 h，有些实验发酵时间过长可能是因为菌种的选择或者发酵条件不同而延长了发酵时间[38-39]；最佳发酵温度范围为30～40 ℃，普遍在30 ℃左右；初始含水量在50%左右；最佳接种量及菌种接种比例不尽相同，可采取单因素试验[35]、正交设计[38]、响应面法[37]等进行优化，通过检测棉粕发酵前后的营养成分而定。此外，有研究者在加入益生菌的基础上增加了酶解处理[41]，经菌酶协同发酵后，棉粕中游离棉酚含量下降更明显且粗蛋白质和小肽含量也有明显的升高。还有研究者选用袋式固态发酵处理棉粕[42]，棉粕的营养价值提高，且经60 d 的持续监测，发酵棉粕内霉菌含量从1.0×105CFU/g 降至1.0×104CFU/g，说明呼吸袋可以实现棉粕湿料成品的长时间储存，且便于运输。

3 发酵棉粕的脱毒和营养价值改善

3.1 棉粕脱酚

棉粕中的游离棉酚是一种呈黄色结晶的有害多酚物质。据报道，游离棉酚具有细胞毒性、神经毒性及肝毒性，摄入量多或长期摄入会在体内蓄积引起中毒症，干扰机体免疫功能和生殖功能，严重还可导致动物死亡[43-44]。目前，棉酚脱毒方法包括物理法、化学法和生物法。而生物法是采用先进的发酵工程技术，对棉粕进行发酵处理，利用微生物或者酶制剂降解棉粕中的游离棉酚等有毒物质，进而提高棉粕在饲料中的利用率。朱德伟等[45]选用热带假丝酵母JD-9 和卡氏酵母JD-13固态发酵棉粕，通过响应面分析法和典型性分析确定最佳发酵条件，结果表明，发酵后棉粕中的游离棉酚从987.5 mg/kg 降解至85.9 mg/kg，脱毒率高达91.3%，对游离棉酚的脱毒效果非常好，这与Zhang 等[46]的结果一致。洪振[47]的研究显示，乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌是对棉粕脱毒效果最好的三种菌，经固态发酵后的棉粕游离棉酚含量显著减少，脱毒率达到85.11%。徐晶等[23]选用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、黑曲霉、假丝酵母、粪肠球菌等12 株菌对棉籽粕进行固态发酵，发现地衣芽孢杆菌、产朊假丝酵母、热带假丝酵母及酵母菌对游离棉酚均有脱毒效果，且地衣芽孢杆菌Bl2 脱毒效果最佳，脱毒率为42.7%。敖维平等[48]通过对比微生物发酵和化学法对棉粕脱毒的效果发现，利用微生物发酵对棉粕脱毒的效果与传统硫酸亚铁法无明显差异，这表明生物法可作为发酵脱毒处理棉酚的有效方法。

但对于微生物发酵棉粕脱毒的机理，研究者们众说纷纭，目前还没有明确的解释。有些研究者认为通过微生物发酵将棉粕中的游离棉酚转化、降解而脱毒[49]；另一些研究者则认为，棉粕在固态发酵过程中，游离棉酚与棉粕其他部位相结合形成结合态棉酚导致棉酚毒性降低[50-54]；周生飞[55]利用近平滑假丝酵母（C.parapsilo⁃sisKDN0118）发酵降解棉酚，依据棉酚分子结构、已鉴定的中间代谢产物及其化学结构推断其降解代谢途径，主要有两条：其一为棉粕中的游离棉酚通过发酵与菌体氧化酶作用发生苯环的开环反应，但棉酚进一步的代谢产物在适用棉酚的液相条件下无法被检测到，推测可能降解成的小分子被菌株快速利用导致不易检测；另一条是棉酚与赖氨酸结合发生褐色反应，形成结合棉酚，但具体的代谢途径和机理还有待深入的研究。

3.2 提高棉粕营养价值

大量的研究证明，利用益生菌固态发酵棉粕不仅能够有效降低游离棉酚含量，还可提高棉粕的营养价值，改善饲料适口性[9]。罗远琴等[28]检测了选用枯草芽孢杆菌、酿酒酵母及其复合菌分别发酵棉粕的营养成分、棉籽肽含量及分子质量分布的变化，结果显示，枯草芽孢杆菌发酵组中棉粕的粗蛋白质(CP)、干物质(DM)、粗灰分(Ash)有极显著提高；3 个发酵组中棉粕的钙、磷含量均有提高，混菌发酵组极为显著，且混菌发酵组的酸性洗涤纤维(ADF)、粗脂肪（EE）有极显著的降低；同时，发酵组的总游离氨基酸含量和棉籽肽含量也明显升高，这表明，通过发酵不仅将棉粕中大分子蛋白明显降解为小分子蛋白、游离氨基酸和棉籽肽，还能显著改善棉粕的营养价值。陈如水等[56]检测了棉粕经啤酒酵母菌、凝结芽孢杆菌和德氏乳酸杆菌发酵处理后粗蛋白质、粗纤维和氨基酸含量的变化，与发酵前相比，发酵棉粕的粗蛋白质和氨基酸含量均有提升，粗纤维含量显著降低。Zhang等[57]研究了6种微生物对棉籽粕发酵后营养价值的影响，发现黑曲霉ZD-8和热带假丝酵母ZD-3的发酵效果最好，经这两种菌发酵后的棉粕粗蛋白质、总氨基酸和必需氨基酸含量分别提高了22.24%和10.76%、11.46%和7.06%、12.64%和7.77%。金红春等[58]研究显示，与对照组相比，利用复合芽孢杆菌固态发酵棉粕，发酵产物中淀粉酶和脂肪酶活力分别提高了766、299 U/g。韩伟等[59]用枯草芽孢杆菌、酿酒酵母固态发酵棉粕后检测其毒性因子和营养成分的变化，发现经60 h发酵和酶解后的棉粕游离棉酚含量降低超过40%，酸溶蛋白质提高了108.7%，粗纤维降低约12.7%，饲料中枯草芽孢杆菌和酿酒酵母活菌数分别为7.75、7.00 lg（CFU/g）。

3.3 降低棉粕中其他抗营养因子及有害物质

棉粕中除了棉酚，还有一些抗营养因子，如环丙烯脂肪酸、单宁、黄曲霉毒素和植酸等[60]。乔晓艳等[61]利用热带假丝酵母JD-9和干酪乳杆菌MX-48混合发酵棉粕后发现，植酸含量从1.83%降到0.29%，这表明两株菌在发酵棉粕过程中会产生植酸酶来降解植酸，缓解了植酸所导致的阻碍动物对必需矿物质元素的吸收和利用。宋文静[62]的研究显示，利用芬氏纤维微菌固态发酵棉粕可高效地将棉粕中的黄曲霉毒素B1去除，经过深入研究发现是芬氏纤维微菌胞外代谢产物中的蛋白质及其他成分发挥了主要去除作用，去除方式可能通过吸附作用，防止棉粕霉变，延长棉粕饲料的保质期。

4 发酵棉粕在动物生产上的应用

4.1 发酵棉粕在家禽上的应用

目前，关于发酵棉粕在畜禽饲粮中的应用研究，相对来说国外研究较少，主要还是集中在国内。有研究表明[61]，与未发酵组对比，利用热带假丝酵母JD-9和干酪乳杆菌MX-48发酵棉粕可使得棉粕中蛋氨酸提高35.48%，同时其他必需氨基酸也均有不同程度的提高，这表明发酵棉粕适合作为家禽饲粮的有效蛋白质资源。朱元召等[63]选用酵母菌（包括毕赤酵母和酿酒酵母）、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、粪肠球菌按1∶1∶1∶1 制成复合菌液发酵棉籽粕和菜籽粕等非常规蛋白饲料饲喂蛋鸡，发现使用发酵棉籽粕和菜籽粕替代4%豆粕的实验组饲喂效果最好，产蛋率、日采食量及蛋品质均有提高。

禚梅等[64]的研究显示，饲料中添加5%发酵棉粕代替豆粕对产蛋后期的罗曼褐壳蛋鸡在产蛋率、料蛋比、体重增长、经济效益指标方面优于基础日粮组、添加5%棉仁蛋白组及添加2%植物油组。陈生琴[65]用红平红球菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌三种菌混合固态发酵棉粕，在最优发酵条件下按照不同比例替代豆粕饲喂海兰褐蛋鸡，对其生长性能、蛋品质和血清生化指标、免疫器官指数以及肠绒比的变化进行测定，结果表明，与对照组相比，在饲粮中添加未发酵棉粕组产蛋鸡的生长性能、蛋品质和血清生化指标、免疫器官指数和肠绒比均显著降低，而通过比较添加不同比例的发酵棉粕替代豆粕组产蛋鸡的以上指标无显著变化，但从结果来看，替代比例为6%时以上指标有升高趋势。魏尊[66]的研究结果也表明，用嗜酸乳杆菌发酵棉粕后在日粮中替代10%豆粕饲喂50周龄的海兰褐蛋鸡，其生产性能、蛋品质及血清生化指标均达到最佳饲养效果。有研究显示，使用没有经过发酵或脱酚的棉粕饲喂蛋鸡随添加量的增加会使得蛋黄颜色改变，出现“桃红蛋”等异常情况[67]，而饲喂发酵后的棉粕可以显著改善这种情况，且贮藏蛋黄液也没有出现斑点、变浅绿色或暗红色[68]，这表明棉粕通过发酵降低了游离棉酚含量从而改善了对蛋黄颜色的影响，提高了棉粕的利用效果。

Wang等[69]选用枯草芽孢杆菌ST-141和酿酒酵母N5发酵棉粕，并将发酵棉粕部分替代豆粕应用于AA肉鸡的日粮中，结果显示，饲喂发酵棉粕组AA肉鸡的生长性能、血清中的免疫球蛋白水平、血清和肝组织的抗氧化能力均显著高于饲喂未发酵棉粕组的肉鸡，同时，饲喂肉鸡发酵的棉粕可提高其盲肠内乳酸杆菌及总厌氧细菌的数量，改善肠道环境。Niu等[70]研究了由热带假丝酵母发酵的棉粕对白羽肉鸡脂肪沉积、盲肠微生物群落和代谢产物及其相互作用的影响，结果表明，发酵棉粕组肉鸡的腹部脂肪和皮下脂肪厚度均显著降低，同时饲喂发酵棉粕增加了肉鸡盲肠中拟杆菌的相对丰度，减少了与肥胖相关的微生物；肉鸡盲肠代谢组学分析表明，饲料中添加发酵棉粕会显著改变盲肠中的脂质、有机酸、维生素和多肽，这表明饲喂发酵棉粕可通过调节肉鸡盲肠微生物群落和代谢产物来减少脂肪沉积，进而对肉鸡机体和生长性能产生积极的影响。

此外，姚艳辉等[71]在日粮中添加发酵棉粕替代豆粕饲喂肉鹅发现其体尺性能指标、内脏发育指标和血液指标均无显著差异，且在早期能有效促进肉鹅生长。周媛媛等[72]在肉鸭饲料中添加9%的发酵棉粕替代豆粕，结果显示，肉鸭对营养物质利用率及生长性能显著提高，这与王婷[38]的研究结果一致。

4.2 发酵棉粕在家畜上的应用

在用棉粕作为饲粮饲喂畜禽时，如果使用浓度超过其规定的安全使用范围，就会使畜禽中毒[73]，从而产生一些病理性的不良反应，同样在给反刍动物饲喂一些高剂量的棉粕之后，也会显示出一些与单胃动物很相似的病理反应[74-75]，因此，发酵棉粕显示出极高的应用价值。张国民等[76]用“兴牧一号”微生物菌液发酵棉粕替代豆粕饲喂犊牛，结果显示，饲喂发酵棉粕的犊牛被毛平顺、毛色发亮、粪便正常、且产气量（NH3、H2S）及腹泻次数低于对照组，这表明发酵棉粕具有健胃润肠，促进机体血液循环的作用。另外，使用发酵棉粕替代豆粕饲喂犊牛不仅加快其采食速度，还使饲料成本降低21.37%，大大提升经济效益。还有研究表明，在安格斯肉牛的日粮中添加6%的嗜酸乳杆菌发酵棉粕可显著提高肉牛的日增重和采食量，血清中总蛋白、免疫球蛋白G含量也有显著提升，试验组日粮中粗蛋白质、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维表观消化率显著高于对照组，说明饲喂发酵棉粕可有效改善安格斯肉牛的生长性能、血清生化指标和日粮养分消化率[77-78]。郭春燕等[79]的研究也证明添加20%的发酵棉粕对荷斯坦奶牛产奶量及乳成分无不利影响。

此外，马丽等[80]在生长猪的日粮中添加5%～10%发酵棉粕，饲喂的生长猪日增重、采食量和料重比等生长性能指标无显著影响但有提升的趋势，添加5%发酵棉粕的试验组腹泻率下降，而多加了发酵棉粕的组则略有增加，表明发酵过程中产生的有机酸和通过发酵饲料进入肠胃的益生菌定植可改善胃肠道健康，但过量发酵棉粕对肠胃也有不利影响，所以需找到适宜的发酵棉粕添加量。王春芳[81]用乳酸菌发酵的棉粕部分替代豆粕饲喂70日龄的“杜×长×大”三元杂交生长肥育猪，并检测饲喂80 d后其生长性能及血液游离棉酚含量的变化，试验结果显示，与对照组相比，以发酵棉粕替代20%和30%豆粕饲喂生长猪，猪的日增重、日采食量、料重比无显著差异，且血液中未检测出游离棉酚，这表明发酵棉粕可以部分替代豆粕用于生长猪的饲养且对其生长性能及机体健康无影响。

4.3 发酵棉粕在水产动物上的应用

棉粕中的游离棉酚有一定的毒性，而且会对鱼类等水产动物的健康产生不良影响，但是由于水产动物较短的消化道，游离棉酚会更加容易地被排出体外[82]，从而在一定程度上降低了它的毒性。对于棉粕在水产动物上的应用，国内外有着很广泛的研究，《无公害食品 渔用配合饲料安全限量》（NY 5072—2002）和《饲料卫生标准》（GB 13078—2017）规定，冷水性鱼类和海水鱼类配合饲料中游离棉酚的使用量不得超过其安全使用上限（150 mg/kg）[83]，而棉粕通过发酵显著地降解其中的游离棉酚，这更能表现出发酵棉粕应用于水产动物饲料中的优势。

金红春[84]筛选了适合发酵棉粕的地衣芽孢杆菌、酿酒酵母等6种菌，当6种菌以等比例添加发酵棉粕时效果最好，将该发酵棉粕加入青鱼饲料中，探究发酵棉粕对青鱼生长性能、生理指标的影响，结果显示，与对照组相比，发酵棉粕组青鱼的存活率、增重率显著提高，饵料系数、肝脏和血清中的谷草转氨酶显著降低。还有研究者用发酵棉粕替代豆粕饲喂草鱼和鲫鱼得到了和上述一致的结果，同时还发现随着发酵棉粕添加量的增加，水质中氨氮和亚硝酸盐呈下降的趋势[85-86]。

5 展望

虽然发酵棉粕的工艺及其在动物生产中的应用研究均取得较好的成果，但还有许多问题需要在实践中探究和解决。例如，目前多数研究者考察发酵棉粕在动物体内如何进行代谢和发挥有益作用，但微生物在发酵棉粕中是如何对抗营养因子和营养物质进行转化和代谢，其作用机理还鲜见报道。蛋白质资源短缺是饲料和养殖行业面临的难题之一，开发新型的饲粮蛋白质是目前研究的重点。棉粕经发酵后营养价值明显改善，但能否作为豆粕替代物应用于动物生产及其在饲料中的替代比例如何确定还没有形成成熟的方案。因此，为解决我国蛋白质饲料资源短缺的问题，搞清微生物发酵棉粕的作用机理，开发出高效降解游离棉酚的微生物制剂及发酵棉粕的生产工艺，并探索出发酵棉粕在动物生产中的最佳应用方案，是未来发酵棉粕的研究方向。