非洲猪瘟病毒CD2v抗体间接ELISA方法的建立及其初步应用

凌占业，徐 倩，杨洪雨

(河南省黄泛区鑫欣牧业股份有限公司，河南 周口 466632)

非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病，属于非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员，发病患畜多表现为高热、皮肤发绀、内脏器官明显出血、呼吸障碍及神经症状等，强毒株感染后发病率和死亡率最高可达100%，对养猪业造成重大的经济损失。1921年，英国兽医学家Montgomery等首次报道肯尼亚的ASF疫情[1-2]；2007年，ASF疫情在高加索地区的格鲁吉亚出现，随后迅速蔓延至俄罗斯联邦以及东欧等周边国家[3-4]；2018年8月1日我国辽宁省沈阳市沈北地区发现了ASF疫情，经B646L/p72基因进化树分析发现该病毒属于基因Ⅱ型，与俄罗斯和东欧流行的Georgia 2007/1毒株属于一个进化分支[5]，目前我国多处如江苏、安徽、河南及内蒙古等已发现ASF疫情。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。

ASFV是一种有囊膜的单分子双链DNA病毒，大小约为170～190 kb，在其基因组结构中，中间125 kb为保守序列，两端为可变区，基因组含有151～167个开放阅读框(ORFs)，编码150～200种蛋白质[6-10]，其中存在许多与病毒复制、免疫逃逸、病毒传播等相关的蛋白。ASFV EP402R基因全长为1 083 bp，编码的蛋白大小为41 ku，是嵌入病毒囊膜外表面的膜蛋白，类似于T淋巴细胞表面的黏附受体CD2，所以命名为CD2v[11]。它由信号肽、跨膜域及147个氨基酸的胞质尾组成，是ASFV晚期表达蛋白，可以导致红细胞吸附于病毒感染细胞表面，有助于其在宿主体内扩散[12]；该蛋白具有抑制有丝分裂原刺激淋巴细胞增殖的作用，具体机制可能是通过CD2v细胞外结构域与淋巴细胞表面配体的直接相互作用，或通过CD2v细胞质中结构域与胞质蛋白相互作用而介导[13]。本试验以真核表达的ASFV CD2v蛋白为包被抗原，建立了检测ASFV抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)血清学诊断方法，该方法具有良好的特异性和敏感性，可以用于ASFV抗体检测，以期为CD2v蛋白的生物学功能研究、ASFV血清学诊断试剂的制备及疫苗开发奠定基础，同时对预防外来ASF传入我国提供了检测方法的技术储备。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

试验于2020年10—12月在某公司动物疫病监测中心进行。

1.2 材料

1.2.1 试剂 非洲猪瘟病毒(CD2v)抗体ELISA检测试剂盒购自哈尔滨元亨生物药业有限公司；兔抗猪IgG-HRP(1∶500～1∶5 000)、TMB单组分显色液均购自索莱宝生物科技有限公司；明胶封闭缓冲液购自生工生物工程(上海)股份有限公司；PBS磷酸缓冲液、Albumin Bovine、ELISA酶标板购自郑州科邦生物科技有限公司；其余化学试剂均为国产分析纯试剂。

1.2.2 CD2v蛋白 试验用包被抗原由中国农业科学院提供。

1.2.3 血清 ASFV感染血清10份[由哈尔滨元亨生物药业有限公司的非洲猪瘟病毒(CD2v)抗体ELISA检测试剂盒检测抗体为阳性]由国家非洲猪瘟参考实验室提供；伪狂犬病病毒(PRV-gE)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、口蹄疫病毒O型(FMDV-O)、口蹄疫病毒A型(FMDV-A)阳性血清各3份，健康猪血清40份由中牧实业股份有限公司提供。

1.2.4 试验仪器 生化培养箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)；振荡器(姜堰市新康医疗器械有限公司)；全自动酶标洗板机(深圳市汇松科技发展有限公司)；4 ℃冰箱(青岛海尔股份有限公司)；手提式压力蒸汽灭菌器(宁波凌宏医疗器械科技有限公司)；酶联免疫检测仪(赛默飞世尔上海仪器有限公司)。

1.3 间接ELISA方法的建立及反应条件的优化

1.3.1 最佳包被浓度和血清稀释倍数的确定 采用方阵滴定试验确定最佳反应条件，将纯化后的重组蛋白分别稀释至20 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL、2.5 μg/mL、2 μg/mL、1.25 μg/mL、0.625 μg/mL，加入96孔酶标板，100 μL/孔，37 ℃孵育2 h转入4 ℃包被过夜，次日用PBST洗涤5次；随后1% BSA磷酸缓冲液封闭1.5 h(200 μL/孔)，用PBST洗涤5次；ASFV阳性血清和阴性血清分别按照1∶25、1∶50、1∶100、1∶200稀释，100 μL/孔进行方阵试验，37 ℃下孵育45 min，用PBST洗涤5次；将兔抗猪IgG-HRP二抗稀释至1∶4 000后加入孔中，100 μL/孔，37 ℃作用0.5 h，用PBST洗涤5次；加入TMB避光显色(100 μL/孔)，37 ℃孵育10 min；加入2 mol/L H2SO4终止显色(50 μL/孔)，比较各孔OD450nm值，挑选接近1.0的阳性值，并根据P/N值筛选出最佳抗原包被浓度和血清稀释倍数。

1.3.2 封闭液的筛选 用最佳浓度抗原包被96孔酶标板，分别用含5%脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液、1% BSA磷酸盐缓冲液及含明胶的磷酸盐缓冲液，200 μL/孔，37 ℃下孵育1.5 h，按上述间接ELISA反应测定，筛选出最佳封闭时间。

1.3.3 血清最佳反应时间筛选试验 用最佳浓度抗原包被96孔酶标板，血清孵育时间分别为1.5 h、1 h、45 min、30 min，酶标二抗的孵育时间30 min，37 ℃孵育(100 μL/孔)，按上述间接ELISA反应测定，筛选出最佳孵育时间。

1.3.4 酶标抗体工作浓度与显色时间的确定 将兔抗猪IgG-HRP二抗分别按照1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶5 000用PBST、5%脱脂奶粉、1% BSA及明胶封闭缓冲液进行稀释，其余按上述间接ELISA反应测定，筛选出最佳酶标抗体工作浓度；加入TMB后，分别显色3 min、5 min、10 min，读取OD450nm值，选取P/N值较大的显色时间作为底物显色时间。

1.3.5 稳定性检测 选取非洲猪瘟阳性及阴性共6份猪血清样品，用3批包被的酶标板检测，在同一块酶标板上进行批内重复，不同酶标板之间进行批间重复，每个样品重复检测3次，计算标准偏差及变异系数。

1.3.6 阴阳性判定阈值与检测限的判定 用上述优化的间接ELISA方法检测50份ASFV阴性血清，在样品符合正态分布的条件下，根据测得的OD450nm值，计算平均值和3倍标准差之和，将平均值和3倍标准差作为阴、阳性的判定标准，大于该临界值判定为阳性Positive Cut off(PC)=X＋3SD，小于该临界值判定为阴性Negative Cut off(NC)=X＋3SD，介于二者之间的判为可疑。

1.3.7 特异性试验 用建立的间接ELISA检测方法对伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒O型与A型及非洲猪瘟阳性血清进行检测，每种血清各取3份，并设置ASFV阳性血清与阴性血清作为对照，从而评估本研究建立的ELISA方法的特异性。

1.3.8 灵敏度试验 将非洲猪瘟阳性血清1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400稀释，采用优化的间接ELISA方法，检测不同稀释倍数的阳性血清，根据检测结果判定阳性血清最大稀释倍数，以评价所建ELISA方法的灵敏度。

1.3.9 间接ELISA抗体检测方法的临床应用(符合率试验) 采集河南部分地区猪血清50份，利用建立的ASFV CD2v间接ELISA方法和哈尔滨元亨生物药业有限公司非洲猪瘟病毒(CD2v)抗体ELISA检测试剂盒对10份ASFV感染猪血清和40份健康猪血清进行检测，对比两种方法检测结果的符合率。

2 结果

2.1 抗原包被浓度和血清最佳稀释倍数的确定结果

由表1可知，抗原包被浓度为10 μg/mL、血清稀释倍数为1∶25时，此时P/N值最大，因此抗原的最佳包被浓度为10 μg/mL，血清稀释倍数为1∶25。

表1 方阵滴定结果(P/N值)

2.2 封闭液的选择

由图1可知，以1% BSA(牛血清白蛋白)与明胶封闭缓冲液进行封闭，阳性血清OD450nm值/阴性血清OD450nm值(P/N)最大，因此确定1% BSA与明胶封闭缓冲液为最佳封闭液。

图1 最佳封闭液的筛选

2.3 血清最佳反应时间的筛选

由图2可知，待检的阴阳血清孵育60 min后，抗原与抗体结合比较充分，P/N值最大，所以选择60 min作为待检血清的最佳反应时间。

图2 血清最佳反应时间的筛选

2.4 酶标抗体工作浓度的确定

由图3可知，酶标抗体分别按照1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶5 000稀释时，根据P/N值大小确定二抗的最佳稀释比例，其中稀释到1∶2 000时，P/N值最大，因此酶标抗体的最佳工作浓度为1∶2 000。

图3 酶标抗体最佳工作浓度的确定

2.5 酶标抗体最佳稀释液的确定

由图4可知，用PBST以1∶2 000稀释二抗时，根据P/N值大小确定最适稀释液，当稀释液为PBST时，P/N值最大，因此酶标抗体的最佳稀释液为PBST。

图4 酶标抗体最佳稀释液的确定

2.6 TMB最佳显色时间的确定

由图5可知，根据上述试验优化好的条件，加入TMB后分别显色3 min、5 min、10 min，根据P/N值大小确定显色时间。TMB孵育10 min后，P/N值最大，故选择10 min作为TMB显色底物的孵育时间。

图5 TMB最佳显色时间的确定

2.7 重复性试验

由表2可知，用同一批次包被的酶标板检测6份血清，每份血清3个重复，结果显示，批内变异系数均＜10%，说明所建ELISA方法具有较好的批内重复性；用3个不同批次的酶标板检测6份血清，结果显示批间变异系数均＜10%，3份阳性血清检测均值的批间变异系数均大于批内变异系数，同时3份阴性血清中仅有1份检测均值的批间变异系数小于批内变异系数，故说明所建的ELISA方法批间重复性稍差于批内重复。

表2 稳定性结果

2.8 临界值的确定

由表3可知，将确定为ASFV阴性的50份血清进行ELISA检测，得出样本平均OD450nm值为0.228，标准差为0.046，将(平均值＋3倍标准差)作为阴、阳性的判定标准，结果可知，阳性临界值为0.366，当待检样品大于该临界值判定为阳性，小于0.32判定为阴性，介于二者之间则判定为可疑。

表3 阴阳性判定阈值的确定

2.9 特异性试验

用建立的ELISA方法对PRV-gE、CSFV、PRRSV、FMDV-O、FMDV-A进行检测，结果显示，5种病毒阳性血清的OD450nm值均＜0.366，均为阴性(图6)，表明该方法具有良好的特异性。

图6 特异性试验结果

2.10 灵敏度试验

用建立的ELISA方法对倍比稀释的ASFV阳性血清进行检测，结果显示，当阳性血清稀释50倍时，OD450nm值仍大于0.366(图7)，说明所建ELISA方法具有较好的灵敏度。

图7 敏感性试验结果

2.11 符合率试验

对50份血清(10份ASFV感染猪血清和40份健康猪血清)进行检测，结果显示，本研究建立的非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测方法(iELISA)和哈尔滨元亨生物药业有限公司非洲猪瘟病毒(CD2v)抗体ELISA检测试剂盒共有46份血清检测结果一致，符合率为92%(表4)。

表4 不同检测方法符合率的评价 份

3 讨论

ASF作为一类动物传染病，自暴发后对中国养殖业造成了严重的打击，虽然很多学者一直致力于该疫苗的研发，但目前为止仍无有效的商品化疫苗用于该病的预防。疫情发生后主要采取扑杀和净化等措施，且防控多集中在加强基础饲养管理、构建生物安全体系、及时检疫等，因此建立一种ASFV快速高效的检疫方法尤为重要。

EP402R基因是ASFV参与免疫逃避的关键基因之一。有研究表明，敲除MaLawi Li1-20/1毒株的EP402R基因延迟了病毒血症及病毒的传播；基因Ⅰ型分离株BAV71病毒株中敲除该基因，导致病毒毒力减弱并诱导对强毒攻击的完全保护[14-17]。目前国内研究较多的是MGF360/505R家族和CD2v双基因缺失株[11,17-21]，结果表明，基因Ⅱ国内分离株EP402R(CD2v)基因单独缺失对病毒毒力影响有限，而MGF基因(含3个MGF505基因和3个MGF360基因)缺失后，高剂量引起家猪发烧，低剂量则无此表现。在MGF缺失的基础上进一步缺失EP402R基因后，MGF缺失株的毒力也随之下降，但该候选疫苗的长期安全性还有待考证[22]。所以，建立ASFV CD2v抗体间接ELISA检测方法在一定程度上可以推动ASFV双基因缺失苗的研发。

本研究选择了ASFV的CD2v蛋白进行了真核表达，基于真核表达系统在蛋白翻译后修饰方面的较原核表达系统存在的优势，即具有同大多数高等真核生物相似的翻译后修饰加工，如二硫键的形成、糖基化、磷酸化和正确折叠等，使表达蛋白在结构和功能上能够接近于天然蛋白，抗原表位能够最大限度的保留，重组表达则为可溶性表达。但真核表达系统也存在一定的缺陷，表达量偏低，通过常规纯化技术很难获得靶蛋白。

以该纯化的蛋白为包被抗原建立检测ASFV血清抗体的间接ELISA方法，由于附着在酶标板底部的重组蛋白在空间构象、存在形式、分布和排列方式等方面与侵入机体引起免疫应答的病毒并不完全吻合，所以在进行实际样品检测时会有假阳性结果，即检测的敏感性降低，而造成这一结果的主要原因可能与抗原抗体的特异性结合有关，即抗原的特异性取决于抗原分子中的抗原决定簇，其只能与所感染病毒产生的特异性抗体结合。另外，本试验通过验证该方法的灵敏性发现，不同批次的包被抗原其纯化效果可能不同，若杂蛋白含量较多，血清中的成分与杂蛋白非特异性结合易造成检测限降低，出现假阳性。此外，试验对待检血清要求比较高，应避免样品因采集、贮存或处理不当等因素而造成的样品污染、溶血、样品凝集不全等，因为一旦操作不当极有可能影响试验结果或污染实验室存在散毒的风险。

同时，本试验对酶标二抗的工作浓度与稀释液以及TMB(四甲基联苯胺)显色时间进行了筛选比较后发现，不同的封闭试剂其浓度和类型也会增加非特异性背景，有时BSA的封闭效果优于脱脂奶粉，但有些抗体在脱脂奶粉封闭的情况下才能得到清晰的背景。另外，若酶标二抗的使用比例过高，极易造成背景值偏高，导致非特异性显色。同等条件下，酶标二抗的稀释液不同，所测得的OD值也会存在差异。因此，本试验最终选取1%BSA与明胶封闭缓冲液进行封闭，以PBST作为稀释液(符合兔抗猪IgG-HRP要求)，1∶2 000作为酶标二抗的工作浓度继续进行后续试验。

4 结论

本试验通过对已知背景的血清进行检测，验证了基于CD2v蛋白建立的间接ELISA方法的稳定性、灵敏性、特异性及与元亨试剂盒之间的符合率，结果表明该方法稳定、可靠，为下一步研制ASFV的间接ELISA试剂盒提供参考依据，也为控制ASFV的传播提供技术储备。虽然该方法可以很好地检测出标准阳性血清样品，但对其他临床血清样品检测效果如何，还需进一步求证，通过大量检测不同的血清样品，积累试验数据，完善检测方法。目前关于非洲猪瘟基因缺失苗研究的较少，其原因在于ASFV自身结构复杂，病毒感染和免疫机制并不十分明确，而且ASFV产生的中和抗体不具有中和活性。所以后续若有ASF基因缺失苗应用于市场，而我们所建立的方法则对ASF疫苗免疫后的抗体水平有一定的监测作用。