硅胶基质固定相离子对反相液相色谱法测定强离解化合物的正辛醇/水分配系数

刘小兰, 高 薇, 梁 超, 乔俊琴*, 王 康, 练鸿振*

(1. 生命分析化学国家重点实验室, 南京大学化学化工学院, 南京大学现代分析中心, 江苏 南京 210023; 2. 济川药业集团有限公司, 江苏 泰兴 225441)

正辛醇-水分配系数(logP)是化合物亲酯性/亲水性的量度,是表征化合物整体疏水性的重要参数,可用于研究有机小分子和生物体之间的相互作用,在指导药物合理设计及毒性机理研究[1]、环境风险评价[2,3]以及生物降解研究[4]中具有重要作用。logP测定的经典方法为摇瓶法(SFM)[5]和慢搅法(SSM)[6],但测试需要大量样品,成本很高且费时。反相液相色谱法(RPLC)是经济合作与发展组织(OECD)推荐的间接测定logP的有效方法,它是利用与待测物质结构相似且已有准确可靠logP值的化合物作为模型化合物,通过测得特定条件下模型化合物的保留因子对数值logk,建立logP与logk之间的定量结构-保留行为关系(QSRR)模型,进而求得被测化合物的logP值[7]。logP对应化合物中性状态的疏水性,对于离解性化合物,通常采用表观正辛醇-水分配系数(logD)来表征物质在不同pH条件下的疏水性。研究发现,与logP-logk模型相比,以100%水相作流动相时的保留因子对数值(logkw)与logP或logD之间具有更好的相关性,即Collander方程[8]。目前,利用RPLC研究中性化合物的logP[9]以及利用离子抑制反相液相色谱法(IS-RPLC)研究弱酸或弱碱化合物的logP或logD已经比较成熟[10,11]。然而,对于强离解化合物,使用IS-RPLC法分析时,即使在极低比例的有机调节剂和极端pH条件下,也很难得到有效保留。

离子对反相液相色谱(IP-RPLC)作为IS-RPLC的补充,通过在流动相中添加离子对试剂增强溶质的保留,专门用于强离解化合物的分离分析[12-15]。但有实验logP或logD值的强离解化合物很少,不利于QSRR模型的建立,目前,IP-RPLC用于强离解化合物logP或logD的研究还非常少。20世纪90年代,邹汉法等[16]利用IP-RPLC以苯磺酸作为模型化合物,建立了logD-logkw预测模型,但模型化合物logD的获取均来源于计算方法,因此,对于logD实验值预测的准确性不能保障。最近,本课题组Liang等[17]在聚乙烯醇基质C18柱上,以溶质静电荷(ne)、氢键酸性参数(A)和氢键碱性参数(B)沟通了有实验logD值的中性化合物、弱酸和强酸化合物,作为混合模型组,建立了更为可靠的logD预测模型,为强离解化合物logD实验值的获取提供了研究基础。

然而,聚乙烯醇基质色谱柱的柱效和寿命均比传统硅胶基质色谱柱低,为了考察Liang等[17]提出的测定强离解化合物logD模型的通用性,本文采用最常规的硅胶基质C18柱,通过扩大模型化合物的范围,以磷酸二氢铵为缓冲盐,四丁基溴化铵作为离子对试剂,甲醇为有机调节剂,使用等度洗脱的方法获取了26种中性化合物、47种离解化合物分别在IS-RPLC和IP-RPLC模式下的logkw值,建立了相应的logD-logkwQSRR模型。

1 实验部分

1.1 药品与试剂

实验中所用色谱级甲醇购自Honeywell公司(USA),所用水均为饮用纯净水(杭州娃哈哈集团);分析纯磷酸二氢铵、氨水(25%～28%)和磷酸(85%)均购自南京化学试剂股份有限公司,分析纯四丁基溴化铵(99%)购自北京百灵威科技有限公司。

实验中所用化合物列于表1, logP和pKa值为ACD/Labs软件数据库模块中的文献实验值,溶质静电荷ne、氢键酸碱性参数A、B由https://ilab.acdlabs.com/iLab2/获取。这些化合物分别购自Accu Standard (USA)、TCI(Japan)、国药集团化学试剂有限公司(上海)、Acros Organics(USA)、Matrix Scientific (USA)和Sigma-Aldrich (USA),所有物质的纯度均大于98%。

表 1 实验用化合物的log P、 pKa、 log D7.0、 log kw-IS、 log kw-IP、 ne、 A和B值

表 1 (续)

1.2 仪器与设备

实验所用高效液相色谱仪为Waters Alliance 2695(Waters, USA),配有真空脱气机、四元梯度泵、自动进样器、柱温箱和紫外-可见二极管阵列(PDA)检测器。数据的采集和处理均在Waters Empower色谱管理系统中进行。

pH值的测量使用SevenMulti型pH/电导率/离子综合测试仪(Mettler-Toledo, Switzerland),校准溶液为pH 4.01、7.02和9.26(25 ℃)的标准缓冲溶液(Mettler-Toledo)。

1.3 色谱条件

实验所用色谱柱为Welch Ultimate®XB-C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm,月旭科技(上海)股份有限公司),硅胶基质,孔径12 nm,比表面积320 m2/g,载碳量17%,封尾,耐受pH为1.5～10.0。实验中柱温始终保持在30 ℃,流速为1.0 mL/min,等度洗脱,每个化合物在最佳吸收波长处检测。实验中各化合物的进样浓度均为50 mg/L(甲醇配制),进样量为5 μL。

1.4 实验方法

在IS-RPLC和IP-RPLC色谱模式下,分别测定各化合物的保留时间(tR),使用尿嘧啶测定死时间(t0)。根据化合物疏水性的差异,每个化合物的tR至少在4个不同的甲醇比例下(φ=80%～10%,间隔10%或5%,φ是流动相中甲醇的体积分数)测定,tR使用双点校正法(DP-RTC)进行校正[19,20]。实验中所有化合物的tR均为至少3次独立进样的平均值。

保留因子k由公式k=(tR-t0)/tR计算得到,然后通过线性溶剂强度(LSS)模型(logk=logkw-Sφ,其中,φ是流动相中有机调节剂的体积分数,S是线性回归得到的常数)获取每个溶质的logkw,随后建立logD-logkw模型。采用Origin 9.4拟合模型并进行相关数据分析。

2 结果与讨论

2.1 log kw值的获取

分别建立每个化合物的logk-φ线性关系,外推获得logkw值,IS-RPLC模式下记为logkw-IS, IP-RPLC模式下记为logkw-IP。我们在前期工作[21]中已证明,中性化合物的保留时间几乎不受离子对试剂加入的影响,且由于中性化合物的疏水性较大,往往需要在较高的有机调节剂比例下获得合适的保留,而在含盐的高比例有机调节剂下再加入离子对试剂,更容易造成盐的析出从而堵塞色谱柱和仪器,因此,对于中性化合物,我们只测定了IS-RPLC模式下的tR值,并以IS-RPLC模式下推导的logkw-IS实验值代表了IP-RPLC模式下的logkw-IP值,即logkw-IS等于logkw-IP。在未加入离子对试剂的条件下,强离解化合物(W21、W27、W33、S2、S6、S10、S13、S14)在色谱柱上的保留极弱,即使在φ=10%时,保留时间依然小于死时间,因此,无法获取它们的logkw-IS。当加入离子对试剂后,大部分离解化合物尤其强离解化合物的保留均得到明显增强。logk-φ关系显示,所有化合物的线性相关系数(R2)均大于0.99,表明在硅胶基质C18柱上,中性、弱离解化合物及强离解化合物的保留行为均符合LSS模型。部分弱离解和强离解化合物在离子对试剂加入前后的logk-φ关系如图1所示,各化合物的logkw-IS和logkw-IP列于表1。

图 1 部分弱离解和强离解化合物在不同流动相下的log k-φ关系Fig. 1 log k-φ relationship of some weakly and strongly ionized compounds with different mobile phases

2.2 log D-log kw-IS模型

中性化合物的logD7.0值(pH 7.0条件下的logD值)等于其logP值。对于有logP和pKa文献实验值的弱离解酸性化合物,其logD7.0值由其logP、pKa以及流动相pH计算获取[22],结果列于表1。部分无logD7.0值的离解化合物(如W22～26、W29～32、S1、S3等)在IS-RPLC模式下有明显保留,根据LSS模型能够获取其logkw-IS值(见表1),因此,可以基于logD7.0-logkw-IS模型测定这部分化合物的logD7.0值。在IS-RPLC模式下,我们以26种中性化合物(N1～26)和20种弱离解酸性化合物(W1～20)为模型化合物,首先在不引入其他参数的情况下,建立logD7.0-logkw-IS模型:

logD7.0=-0.072(±0.022) logkw-IS+

3.928(±0.596)

N=46,R2=0.174 5

(1)

其中,N为模型化合物的个数。可以看出,模型(1)的线性极差,说明除疏水作用外,还存在着其他次级作用影响溶质的保留。因此,我们尝试在logD7.0-logkw-IS模型中分别引入氢键参数A和B以及静电荷ne(列于表1),分别建立相应的模型:

logD7.0=1.251(±0.08) logkw-IS-

1.790(±0.40)A-0.630(±0.32)

N=46,R2=0.925 4

(2)

logD7.0=1.360(±0.105) logkw-IS-

1.271(±0.684)B-1.054(±0.446)

N=46,R2=0.899 3

(3)

logD7.0=1.205(±0.064) logkw-IS+

1.420(±0.190)ne-0.480(±0.232)

N=46,R2=0.952 5

(4)

显然,引入氢键参数A或B后,模型的线性相关性均得到了极大地改善,引入ne后模型的改善更为明显(R2=0.952 5)。这是由于在pH 7.0的条件下,模型中所用弱酸性化合物大多数处于离解状态,且离解状态不同,而此时硅胶基质色谱柱上的硅羟基部分解离,因此,溶质与固定相之间会表现出较强的氢键相互作用和静电相互作用。通过继续优化模型发现,将ne、A和B同时引入后的模型(5)相关性最佳且均方差最小,模型如下:

logD7.0=1.097(±0.077) logkw-IS+

1.648(±0.293)ne+0.524(±0.500)A-

1.236(±0.448)B+0.090(±0.332)

N=46,R2=0.958 3

(5)

表 2 待测化合物的log D7.0实验预测值

随后,我们选用模型(5)预测了在IS-RPLC模式下有保留的19种离解化合物的logD7.0值,结果列入表2中,测定的数据将用于后续IP-RPLC模型的建立和模型的验证。

2.3 log D-log kw-IP模型的建立及强离解化合物log D的测定

Liang等[17]的研究表明,在IP-RPLC模式下,通过引入ne、A和B可以将中性化合物、弱离解以及强离解酸性化合物联系起来建立测定强离解化合物logD值的模型。基于此,我们以中性化合物N1～26、弱离解酸性化合物W2～19以及由IS-RPLC测得logD7.0值的离解化合物W22～26、W28～32、S1、S3～5、S7～9、S11共同作为混合模型组,建立IP-RPLC模式下logD7.0测定的多元线性模型(6):

logD7.0=1.075(±0.077) logkw-IP+

2.366(±0.166)ne+0.120(±0.245)A-

1.554(±0.320)B+0.150(±0.310)

N=62,R2=0.942 5

(6)

可以看出,模型(6)的R2可以达到0.94,说明模型具有良好的线性相关性,充分证明在硅胶基质C18色谱柱上以不同类型化合物作为模型化合物建立logD-logkw-IP模型的可行性。Liang等[16]在聚乙烯醇基质C18柱上得到的多元线性模型如下:

logD7.0=1.18(±0.07) logkw-IP+

1.55(±0.26)ne-0.09(±0.44)A-

0.44(±0.26)B-0.82(±0.31)

N=50,R2=0.954

(7)

对比发现,本工作中在硅胶基质C18柱上模型的相关性与Liang等在聚乙烯醇基质C18柱上模型的相关性非常接近。同时发现,本工作模型中logkw-IP的系数更接近于1,而ne、A和B3个参数的系数均大于在聚乙烯醇基质C18柱上得到的模型系数,尤其是ne的系数,这表明在硅胶基质C18柱上存在着更强的次级作用,参数ne、A和B对模型的贡献更大。

为了验证模型的可靠性,我们选取3种不同类型的离解化合物作为验证化合物,分别为五氯酚(W20)、苯甲酸(W1)和3,5-二(甲氧基羰基)苯磺酸(S12),其中3,5-二(甲氧基羰基)苯磺酸无SFM/SSM文献logD7.0值,其logD7.0标准值采用模型(5)得到的测定值。将3个验证化合物的logkw-IP、ne、A和B带入模型(6),测定其logD7.0,结果见表3。

表 3 log D-log kw-IP模型的外部验证

从表3中可以看出,用模型(6)预测的3种离解化合物的logD7.0与SFM/SSM法(苯甲酸和五氯酚)或者本文IS-RPLC法(3,5-二(甲氧基羰基)苯磺酸)测定得到的logD7.0非常相近,误差在10%以内,说明所建立模型既能测定弱离解化合物的logD值也能测定强离解化合物的logD值,充分证明了模型的可靠性。ACD/Labs软件是公认的最准确的logP和logD计算软件,由表3可见,与标准值相比,当化合物结构较为简单时,如五氯酚和苯甲酸,用ACD/Labs软件计算得到的logD值比较准确,但是当待测化合物的结构稍复杂时,如3,5-二(甲氧基羰基)苯磺酸,由ACD/Labs软件计算得的logD值存在较大的误差,与俞慧敏等[23]的发现一致。

利用模型(6)预测了对苯二甲酸、对氨基苯甲酸、3,5-二羟基苯甲酸、1,5-萘二磺酸、苯胺-2,5-二磺酸、4-磺基苯甲酸、4-羟基苯磺酸和3-磺基苯甲酸的logD7.0值,结果一并列于表3中。结果显示,对这类离解性强、结构较为复杂的化合物,其logD7.0值与ACD/Labs软件计算得到的值之间差别较大,也说明用ACD/Labs软件计算强极性化合物和结构复杂的化合物时需要谨慎。

3 结论

本文在硅胶基质C18色谱柱上分别研究了中性、弱离解和强离解化合物在IS-RPLC和IP-RPLC中的保留行为。研究发现,IS-RPLC模式下,当模型化合物的离解不能被完全抑制时,引入静电荷ne、氢键参数A和B可以有效改善模型的相关性。更为重要的是,在IP-RPLC模式下,我们通过扩大模型化合物的范围,证明了在硅胶基质C18柱上测定强离解化合物logD的可行性,证实了本课题组Liang等提出的利用不同类型化合物作为模型化合物构建QSRR模型用于测定强离解化合物logD值的方案在不同基质色谱柱上的通用性。