食醋中总多酚的测定方法及其不同陈醋产品的含量比较

纪凤娣，魏巍，陶汇源，李东，夏蓉，鲁绯*

(1.北京市营养源研究所，北京 100069；2.镇江恒顺生物工程有限公司，江苏 镇江 212000)

多酚类化合物是植物次生代谢自然合成的化合物，可以在一些天然食物中找到，由于具有潜在的保健治疗作用，这类化合物引起了科学界的广泛关注[1]。适当摄入具有生物活性的多酚类化合物，在预防糖尿病[2]、肥胖症[3]、帕金森病[4]、阿尔茨海默病[5]等疾病方面具有良好的效果。目前，多酚在与食品、制药和材料等有关的应用方面有很大的潜力，也是这些领域的创新热点。

食醋是我国最受欢迎的调味品之一，有着悠久的生产历史[6]。随着食醋对人体健康的潜在影响，其在世界范围内引起越来越多的关注，已有许多报道证实各种醋具有抗氧化、抗菌、促进疲劳恢复、调节血压和调节血糖等功能性治疗特性[7]。多酚类化合物是食醋的重要特征成分，具有抗氧化活性，对食醋的营养价值和产品品质等指标起着重要作用[8-9]。因此，食醋中总多酚的准确定量，对控制食醋的品质具有十分重要的意义。

多酚类化合物是分子中具有多羟基化合物的总称，包括黄酮类化合物和酚酸类化合物等[10]。目前，多酚化合物的分析方法主要有高效液相色谱-紫外可见或二极管阵列检测法[11-12]、毛细管电泳检测法[13-14]和高效液相色谱-质谱联用法[15-16]等。与其他方法相比，这些仪器分析方法具有更高的准确性和更低的检测限，但是，这些基于色谱和质谱的分析方法在应用上也有很大的局限性，包括需要繁琐的样品预处理过程和复杂的仪器，造成每个样品的测试成本偏高。目前，紫外可见分光光度法已广泛应用于多种分析物的定量分析，但由于光谱重叠性强、选择性低，在多组分溶液分析中仍面临挑战。经典的实验室总酚含量测定方法是基于光谱检测的Folin-Ciocalteu法[17-18]，这是一种方便和简单的分析总酚含量的技术，在葡萄酒等多种食品中总酚含量的测定中有广泛应用[19-21]。但是，这些方法在样品处理、试剂用量、显色反应条件和实际测量以及对照标准品等方面各不相同，数据可比性差。而且，迄今为止，我国也还没有应用于食醋中总多酚含量测定的统一方法和相关标准。

本试验采用分光光度法测定食醋中总多酚的含量。Folin-Ciocalteu试剂中的钼钨酸盐氧化多酚化合物中-OH基团并显蓝色，在最大吸收波长760 nm处测定蓝色金属络合物溶液的吸光度，以没食子酸作校正标准定量测定食醋中总多酚含量。通过对包括样品处理、显色剂用量、显色条件和测量时间等影响显色反应的各影响因素进行优化，确定了食醋中总多酚的定量分析方法。该方法简便、准确且检测成本低、仪器普及率高、适用性强。此外，也比较了市售的中国四大名醋(包括镇江香醋、山西老陈醋、福建永春红曲醋和四川保宁醋)中总多酚的含量。研究结论为我国食醋中总多酚含量测定的行业标准的建立提供了理论依据，为当前我国食醋产业生产中实现产品品质的快速精准检测提供了有效的技术手段，有利于现阶段食醋产品的质量控制和品质评价。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

没食子酸(98%)：成都埃法生物科技有限公司；Folin-Ciocalteu试剂(相应酸浓度为2 mol/L)：美国Sigma-Aldrich公司；碳酸钠(分析纯)：北京化工厂。所有稀释液均由美国密理博(Millipore)Milli-Q净水系统生产的去离子水制备。

镇江香醋、山西老陈醋、福建永春红曲醋和四川保宁醋：北京超市市售产品。

1.2 仪器与设备

UV-2550型紫外可见分光光度计 日本岛津制作所；LAB MX-F涡旋混合器 大龙兴创实验仪器(北京)股份公司；CF16RN多用途冷冻离心机 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 没食子酸标准溶液的配制

准确称取没食子酸对照品适量于100 mL棕色容量瓶中，用水溶解后定容至刻度，摇匀，配制成浓度约为100 μg/mL的没食子酸标准溶液。

1.3.2 食醋样品溶液的配制

准确称取0.5 g(±0.0001 g)食醋样品于50 mL棕色容量瓶中，加入约40 mL水，于30～35 ℃超声30 min，在室温下用水定容至刻度，摇匀备用(也可于8000 r/min离心后取上清液备用)。

1.3.3 检测波长的确定

准确量取没食子酸标准溶液、食醋样品溶液及水各1 mL分别置于10 mL棕色容量瓶中，加入4 mL水，涡旋混匀，静置3～5 min后加入0.5 mL Folin-Ciocalteu试剂，涡旋混匀，在1～8 min内各加入1.5 mL 20%的碳酸钠溶液，涡旋混匀，再用水定容至刻度，摇匀。避光放置于30 ℃水浴中2 h，于200～800 nm进行全波长扫描。

没食子酸标准溶液和食醋样品溶液全波长扫描图见图1。

图1 没食子酸标准溶液(A)和食醋样品溶液(B)全波长扫描图Fig.1 The scanning spectra of gallic acid standard solution (A) and vinegar sample solution (B)

由图1可知，没食子酸标准溶液和食醋样品溶液在759.1 nm均有一个最大吸收峰，且空白溶液无干扰，故选择760 nm作为检测波长。

1.3.4 没食子酸标准曲线的制备

准确量取1.3.1项下没食子酸标准溶液0.20，0.40，0.60，0.80，1.0 mL，分别置于10 mL棕色容量瓶中，各加入4 mL水，涡旋混匀后按照1.3.3项下方法进行显色，同时以水为空白样品进行显色，于760 nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、没食子酸标准溶液质量浓度为横坐标进行线性回归分析。标准溶液的浓度分别为2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 μg/mL。

1.3.5 空白溶液的制备

加入5 mL水于10 mL棕色容量瓶中，按照1.3.3项下方法进行显色，于760 nm处测定吸光度。

1.3.6 食醋测试样品的制备

准确量取1.3.2项下食醋样品溶液1.0 mL于10 mL棕色容量瓶中，加入4 mL水，涡旋混匀后按照1.3.3项下方法进行显色，于760 nm处测定吸光度。每个样品做3份平行，结果取平均值。

1.3.7 计算公式

式中：W为食醋中总多酚含量(g/100 g)；c为试验样品溶液中多酚组分浓度(μg/mL)；m为食醋样品的称样量(g)；结果保留三位有效数字。

2 结果与分析

2.1 食醋样品溶液制备用溶剂的选择

准确称取0.5 g(±0.0001 g)食醋样品于50 mL棕色容量瓶中，平行3份，分别加入约40 mL水、25%乙醇和50%乙醇，于30～35 ℃超声30 min，室温下分别用水、25%乙醇和50%乙醇定容至刻度，摇匀后于8000 r/min离心后取上清液备用。准确量取上述食醋样品溶液1.0 mL，按照1.3.3项下方法显色后在760 nm处测定吸光度，综合分析测定结果，确定水作为食醋样品溶液的制备用溶剂。

2.2 显色时间的考察

对试验样品的分析中，其他操作不变，加入显色剂并定容后，在0～180 min内每隔20 min在760 nm处测定吸光度值，结果表明试验样品在显色120 min后，吸光度值趋于稳定，故确定显色反应时间为2 h，并且在随后的20 min内测定得到的吸光度值非常稳定。

2.3 显色剂用量的考察

对试验样品的分析中，其他操作不变，仅改变Folin-Ciocalteu试剂的用量(0.25，0.5，0.75，1.0 mL)，或仅改变20%碳酸钠溶液的用量(1.0，1.5，2.0，2.5 mL)，同法测定吸光度。比较所得吸光度值后确定0.5 mL的Folin-Ciocalteu试剂和1.5 mL的碳酸钠溶液为最佳显色剂用量。

2.4 方法学考察

2.4.1 标准工作曲线

根据1.3.4项下的方法，以没食子酸标准溶液浓度(μg/mL)为横坐标、吸光度值为纵坐标绘制标准工作曲线，得到线性回归方程为Y=0.1148X-0.2087，相关系数R2=0.9992。结果表明没食子酸在2.0～10.0 μg/mL的浓度范围内线性关系良好。

2.4.2 精密度试验

取1.3.4项下10.0 μg/mL的测试用标准溶液，于760 nm处连续测定吸光度9次，RSD为0.051%，表明该方法的精密度良好。

2.4.3 稳定性实验

准确量取1.3.2项下的食醋样品溶液1.0 mL，按照1.3.3项下方法进行显色反应2 h，然后于760 nm处每隔5 min测定一次吸光度值。结果显示：显色反应完成后，测试样品在20 min内吸光度值的RSD为1.40%，表明样品吸光度值在20 min内基本稳定。

2.4.4 方法的准确性和重复性

以Folin-Ciocalteu法测定总多酚，试验会受到多种干扰化合物(包括抗坏血酸、糖(果糖和蔗糖)、芳香胺、二氧化硫、有机酸和Fe(II)等)的干扰，这些干扰物质在水溶液中溶解性良好。众所周知，食醋是以乙酸为主要成分的一种酸味调味料，在我国传统的食醋中除乙酸外，还含有多种有机酸、氨基酸、碳水化合物、酯类、食盐和多种微量天然生物活性物质如四甲基吡嗪、黄酮类化合物和酚酸类化合物。目前，我国国家标准GB/T 19777-2013《地理标志产品 山西老陈醋》规定，山西老陈醋中的总黄酮含量应不低于60 mg/100 g，国家标准GB 2719-2018《食品安全国家标准 食醋》规定总酸(以乙酸计)应不低于3.5 g/dL。显然，高含量的乙酸等有机酸的存在可能会干扰总多酚含量的测定。因此，有必要考察乙酸对试验的影响。

准确称取乙酸含量为4.3%的白醋样品0.5000 g于50 mL棕色容量瓶中，按照1.3项下的方法进行白醋样品溶液的制备和显色反应，结果显示：白醋测试样品的吸光度值与空白样品的吸光度值一致，这说明白醋样品确实不含多酚类化合物，同时也证明食醋中的乙酸对Folin-Ciocalteu法测定总多酚含量的干扰可以忽略。

对测定方法的准确性进行了考察。准确称定6份0.5000 g的食醋样品于6个50 mL棕色容量瓶中，精密加入1.3.1项下的没食子酸标准溶液(没食子酸的加入量为1081 μg)，按照1.3.2食醋样品溶液配制方法对样品进行处理，再依据1.3.3项下显色条件进行显色反应并测定吸光度值。食醋样品加标回收试验测得的吸光度值和计算的回收率见表1。结果显示：平均加标回收率为97.2%，相对标准偏差RSD为1.37%，说明该方法的准确性和重复性好，符合食品安全国家标准GB/T 27417-2017《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》的规定。

表1 食醋样品加标回收试验结果Table 1 The results of spiked recovery test for vinegar samples (n=6)

2.4.5 我国四大名醋样品中总多酚的含量测定

我国各类食醋无论从酿造工艺的特色、产品的质量还是受消费者欢迎的程度，基本上都是从镇江香醋、山西老陈醋、四川保宁醋和福建永春红曲醋这4个类型变化和衍生而来的，因此也称它们为中国四大名醋，是中国传统酿造食醋的代表。对市售5年陈酿四大名醋中的总多酚含量进行了分析，结果见表2。

表2 中国四大名醋总多酚含量测定结果Table 2 The determination results of total polyphenols＇ content in four Chinese famous vinegar

结果显示：四大名醋总多酚含量在0.237～0.604 g/100 g的范围内。其中，四川保宁醋的总多酚含量最高，为0.604 g/100 g，福建永春米醋的总多酚含量最低，为0.237 g/100 g。这证明不同工艺、不同品牌的食醋产品总多酚含量不同，而总多酚含量是评价食醋品质的重要指标之一。

3 结论

本试验对基于Folin-Ciocalteu法测定食醋中总多酚含量的影响因素进行了考察和优化。通过对食醋样品处理条件、显色反应时间、显色剂用量和测量时间等因素的考察，确定了食醋中总多酚含量的测定方法为：准确称取0.5 g(±0.0001 g)食醋样品于50 mL棕色容量瓶中，加入4 mL水，涡旋混匀，静置3～5 min后加入0.5 mL Folin-Ciocalteu试剂，涡旋混匀，在1～8 min内各加入1.5 mL 20%的碳酸钠溶液，涡旋混匀后再用水定容至刻度，摇匀。避光放置于30 ℃水浴中2 h显色，并在20 min内于760 nm处测定吸光度。该方法溶液体系均一，线性良好，准确度和稳定性高，精密度和重复好，仪器普及率高且操作方便、简单，产生的数据可比性强，易于推广，可以应用于食醋产品质量控制和品质评价中总多酚含量的测定。