基于科研成果的园艺植物病理学综合性创新实验教学探索

向妙莲　徐昭焕　马建　陈明

【摘要】为增强大学生的创新意识和科研素养，探讨综合性创新实验教学在园艺植物病理学实验课程中的应用，设计了“茉莉酸甲酯（MeJA）诱导梨果实抗青霉病的效应与机理”实验，包括MeJA对青霉病菌（Penicillium italicum）的抑菌活性、诱导梨果实抗青霉病效应及对梨果实病程相关蛋白几丁质酶（Chitinase，CHI）活性和β-1，3-葡聚糖酶（β-1，3-glucanase，GLU）活性的影响。实践表明，基于植物病理学基础理论的综合性创新实验有助于学生掌握寄主-病原互作的基本原理和实验技能，提高学生实验方案设计、实验研究组织和实验结果分析的能力，激发学生的创新精神和科学意识。

【关键词】科研成果  园艺植物病理学  综合实验  创新能力

【基金项目】国家自然科学基金（31360466）;江西省高校省级教改立项项目（JXJG-18-3-30）; 江西省高校省级教改立项项目（JXJG-19-3-9）。

【中图分类号】G640 【文献标识码】A 【文章编号】2095-3089（2021）07-0189-02

园艺植物病理学实验教学是与园艺植物病理学理论课程紧密相关的一个重要教学环节，当前传统的验证性实验教学模式限制了创新性园艺人才的培养。因此，增加综合性创新实验课程占比，以适应新农科背景下实验教学的需要，是目前实验教学改革创新中值得考虑和重视的问题。高校科研成果既可促进生产发展，又可丰富教学资源，有效依托科研优势提升实验教学水平，将科研成果转化为实验教学的创新模式。科研与教学相互转化、相互促进，科研反哺教学，科学研究思维方法和实验操作技能融于一体，具有综合性、前沿性和应用性的特点，旨在提高學生的探索精神，锻炼学生的创新思维以及运用理论知识和实验技能解决具体问题的能力，是目前实验教学改革研究的热点[1-4]。

果蔬采后病害是制约园艺产业发展的瓶颈性障碍，目前主要通过化学药剂控制该病害。为了确保果蔬产品生态、安全，绿色植保防控技术的应用及推广已迫在眉睫 [5-6]。茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）作为植物抗病反应的重要信号分子作用于植物受体细胞进而参与防御信号的传导，调控植物免疫系统，增强植物抗病性[7-8]。几丁质酶（CHI）和β-1，3-葡聚糖酶（GLU）为两类重要的病程相关蛋白，与果蔬采后抗病密切相关[9-11]。MeJA等外源物质处理可诱导果蔬CHI和GLU活性升高，从而减缓果蔬采后病害的发生[12-13]。

1.综合性创新实验特色

园艺植物病理学综合性创新实验基于果蔬采后贮藏保鲜领域研究热点，依托江西省果蔬采后处理关键技术及质量安全协同创新中心和江西农业大学农学院等最新研究成果，将茉莉酸甲酯（MeJA）等外源物质诱导果实抗采后病害研究中取得的部分成果转化为园艺植物病理学实验的一个教学内容，构建具有综合植物病理学知识、强化实验技能训练和将基础知识运用于科技前沿研究特点的实验教学模式[14-15]。综合性创新实验通过强调科学问题热点引领和学生自主设计，学生通过比较MeJA诱导梨果实抗青霉病的效应及对青霉病菌（Penicillium expansum）的抑菌作用差异，逐步将科研成果引入到实验教学中，激发学生学习专业知识兴趣，培养创新思维和创新能力，为学生科研实验和毕业设计奠定基础。

2.综合性创新实验教学设计

2.1实验材料

试验用果：“翠冠”梨果实采自江西省峡江县金坪乡果园，于当日采摘后放置于实验室，挑选无病虫害、大小统一的果实，放置24h充分散去田间热后用0.1%次氯酸钠溶液浸泡果实1～2min消毒后用自来水冲洗干净，室温下晾干后保鲜袋单果套袋，入库备用（冷库温度4～5℃）。

供试菌株：扩展青霉（P.expansum），由江西农业大学植物病理实验室提供，-80℃保存，试验前培养5～7d，用无菌水洗脱孢子，经无菌脱脂棉过滤后用血球计数板计数，配置浓度为1.0×106 spores /mL孢子悬浮液，备用。

供试试剂：茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA），购自美国Sigma公司，先使用微量0.1% Tween80和少许乙醇混合均匀，后加无菌水配置为浓度1000 μL/L的MeJA溶液;异羟肟酸（Salicyhydroxamic acid，SHAM，茉莉酸生物合成合成抑制剂），购自美国Sigma公司，先溶于95%乙醇，再用含0.1% Tween 80的无菌水配置成1000 μL/LSHAM备用;CHI活性和GLU活性测定采用试剂盒（Solarbio，北京，中国），乙酸-乙酸钠缓冲液（含EDTA、β-巯基乙醇）。

2.2 实验方法

2.2.1 MeJA对P. expansum的抑菌活性

采用牛津杯法测定MeJA对P.expansum的抑制作用。取6 mL供试菌株孢子悬浮液加入54mL温度约45℃左右PDA培养基中，摇匀，倒入无菌培养皿制成含青霉菌平板。待平板凝固后，在培养皿中心放置无菌牛津杯（直径为7mm），取100μL浓度为10μmol/L、经0.22μm细菌微孔滤膜过滤的MeJA溶液注入牛津杯中，每个处理重复3次，置25±1℃恒温培养箱逐日观察记录抑菌圈大小。对照组用等量含0.1% Tween80无菌水。

2.2.2 MeJA诱导梨果实抗青霉病效应

将待处理果实置于熏蒸盒（体积6L）内，中央放置灭菌滤纸，将适量 MeJA滴在灭菌滤纸上使盒内MeJA浓度达到10μmol/L，迅速密封塑料盒，对照组用含0.1%Tween80无菌水，另用100μmol/L的SHAM溶液喷施在果实表面，于25℃恒温培养箱内36h，在果实孔内注入20μL1.0×106 spores/mL青霉孢子悬浮液。每处理10个果，3次重复。以上处理后逐日观察梨果实发病情况，采用十字交叉法测量病斑直径，按以下公式计算诱导效果：诱导效果=（对照病斑直径-处理组病斑直径）/对照病斑直径×100%。

2.2.3 MeJ处理对梨果实CHI和GLU活性的影响

试验设5组处理：CK处理组;10、100和1000 μmol/L MeJA处理组;100 μmol/L SHAM处理组。其他方法同2.2.2，每组处理10个果，每组3次重复。接种后第96 h取病健交界处果肉，液氮迅速冷冻置于-80℃超低温箱保存，待用。根据曹建康等方法稍微改进，提取CHI和GLU粗酶液，采用试剂盒（Solarbio，北京，中国）测定其活性。

2.2.4 数据分析

试验数据利用Excel2003和SPSS16.0 统计分析，用单因素方差比较统计各处理平均值的差异，Duncan 氏新复极差法（Duncans new multiple range test）分析各处理间的差异显著性。

3.综合性创新实验结果分析

3.1 MeJA对P. expansum的抑菌活性

培养5 d后MeJA对青霉病菌的抑制作用，与对照相比，浓度为10 μmol/L MeJA的牛津杯周围无抑菌圈。通过抑菌活性实验，学生掌握了PDA培养基的配制和牛津杯法测定MeJA对P. expansum的抑菌方法，逐步熟悉园艺植物病理学研究的实验技能。

3.2 MeJA诱导梨果实抗青霉病的效应

不同浓度MeJA处理对梨果实抗青霉病诱导效应因浓度不同而各异。10和100μmol/L MeJA处理后诱导效应分别为3.45%和14.59%（P <0.05）。

3.3 MeJA处理对梨果实病程相关蛋白活性的影响

10和100 μmol/L浓度MeJA处理组均显著提高了梨果实CHI活性，分别比对照处理提高了11.02%和45.24%。1000 μmol/L MeJA处理组则抑制了CHI活性，为对照组的85.17%（P <0.05）。100 μmol/L MeJA处理组GLU活性最高，为对照组的1.46倍，而10和100 μmol/L处理之间无显著性差异（P <0.05）。

4 .综合性创新实验教学设计

依托外源物质诱导果实抗病的研究热点问题，构建MeJA诱导梨果实抗青霉病的综合性创新实验课，主要教学设计如下：第一，课前准备——指导教师引导学生逐步熟悉实验课程的教学目标和主要内容后，每组4～5人查找果实采后诱导抗病相关文献，以组为单位撰写可行性实验计划，初拟创新性实验设计和方案，指导教师提出修改意见和建议;第二，课中实施——课时总计8学时，其中2学时准备实验材料（PDA、病原菌、果实预处理），3学时完成MeJA-病原菌-果实三者互作处理（接种、取样），3学时（病情统计、GLU和CHI测定，结果分析），各组同学在实验指导老师协助下不断完善实验方案，学习使用仪器设备和统计软件;第三，课后讨论：各组分析讨论后小结实验结果，分析实验成功和失敗原因，如病原菌污染、接种不发病以及酶活性单位差异等问题，最后指导教师总结分析各组实验结果，学生结合资料查阅，比较MeJA诱导梨果实抗青霉病的效应和病程相关蛋白活性差异，分析MeJA诱导抗病的可能途径，撰写实验研究报告。

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作者简介：

向妙莲（1977年10月-），女，苗族，湖南绥宁人，博士，副教授，研究方向：植物寄主与病原物互作。

陈明（1979年8月-），男，汉族，江西武宁人，博士，副教授，研究方向：果实采后生物学。