Meyerozyma guilliermondii 合成碲纳米棒催化PMS 降解丽春红S

孙维良，万光仪，邓国志**

(1. 安徽大学 资源与环境工程学院，安徽 合肥 230601；2. 安徽大学 湿地生态保护与修复安徽省重点实验室，安徽 合肥 230601)

近年来，偶氮染料是染料工业中应用最为广泛的一类含偶氮基团的芳香化合物. 其中Ponceau S作为典型偶氮染料在工业染色中运用广泛，其滞留在环境中会分解成多种致癌芳香胺. 由于共轭键和生色基团的影响，Ponceau S 分子的生化性差、色度高[1]等复杂特点使含Ponceau S 废水成为最难处理的工业废水之一. 因此迫切需要一种安全、快速有效的方法去除水体中的Ponceau S 染料. PMS 活化过硫酸盐是国内外近些年发展起来的高级氧化体系(AOPs)[2]，通过活化PMS 产生氧化能力极强的自由基，对有机污染物具有良好的降解效果. 催化PMS 降解污染物的关键在于寻找合适的催化剂，当前催化剂主要有过渡金属离子[3]、金属硫化物[4]、负载型化合物[5]、掺杂型化合物[6]等.

Te 为多价态的过渡金属：-2、+2、+4 和+6 价，这为利用电子转移活化PMS 提供了可能[7]. 目前制备碲纳米颗粒(TeNPs)的方法有物理法、化学法和生物法. 其中物理法所用设备过于昂贵且只是暂时转移污染物，并没有从根本上去除污染物[8]，化学法成本消耗高[9]且所需的还原试剂有毒，生物法不仅对Te(Ⅳ)具有较强的解毒和代谢能力[10]，而且生物活性高、结构更为稳定，因而考虑生物法，即通过蛋白质、还原酶等代谢产物将其还原成低生物毒性的单质.

经过多年研究，TeNPs 已应用于吸附染料和重金属[11]、抗菌[12]和去除生物膜[13]等. 本实验利用Meyerozyma guilliermondii(季也蒙毕赤酵母菌)，在好氧环境下将Te(Ⅳ)还原并对其还原产物进行纯化表征. 然后以偶氮类染料Ponceau S 为污染物，利用TeNRs 催化PMS 对目标污染物进行氧化降解，并对其降解机制进行分析，为生物化学联合处理偶氮染料提供了新的方向.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种Meyerozyma guilliermondii

1.1.2 培养基 LB 液体培养基：Trypone 10 g/L，Yeast extract 5 g/L，NaCl 10 g/L.

还原液体培养基：（NH4）2SO40.255 g/L，NaCl 0.46 g/L，MgSO4·7H2O 0.024 g/L，K2HPO40.225 g/L，KH2PO40.225 g/L，HEPes 4.766 g/L，微量元素储备液5 mL/L；pH=7.0.

LB 固体培养基和还原固体培养基：在上述成分之外加入18.0 g/L 的琼脂.

培养基在121 ℃灭菌15 min.

1.1.3 试剂 二乙基二硫代氨基甲酸酯(DDTC)、三羟甲基氨基乙烷(Tris)、盐酸(HCl)、L-组氨酸、叔丁醇、乙醇和苯酚，本实验采用的试剂均为分析纯.

亚碲酸钠(Na2TeO3)采购自上海麦克林生化科技有限公司，PMS 采购自上海萨恩化学技术有限公司.

1.2 方法

1.2.1 菌株 的筛选及 培养 取5 g 土样接 种到50 mL LB 培养基中30 ℃、150 r/min 培养48 h；取培养液2 mL 加至pH=7.0 的还原培养基培养72 h；待培养基混浊. 上述步骤筛选3 代后取10 μL 培养液在含0.1 mmol/L Te(Ⅳ)的LB 固体平板上划线，30 ℃培养箱中培养24 h，当LB 固体培养基上菌落呈黑色时，证明所得分离菌株可还原Te(Ⅳ)，继续纯化3 次后，于超低温冰箱保种.

冰 箱 取 出 保 种 的 菌 转 至50 mL LB 培 养 基中，在30 ℃、150 r/min 好氧培养24 h，离心收集(8 000 r/min，5 min)，用灭菌的还原培养基重悬离心，重复3 次. 打开分光光度计预热20 min，取50 μL菌液稀释100 倍使OD600=1.0，计算接菌量.

1.2.2 菌株合成TeNRs 将菌株接种至含有10 g/L葡萄糖的还原培养基中，在30 ℃、150 r/min 避光培养.

1.2.3 Te(Ⅳ)的测定方法 溶液中亚碲酸盐的测定方法采用文献中描述的DDTC[14]方法：取1 mL 上 清 液 在9 727 r/min 下 离 心10 min，依 次加 入0.5 mol/L Tris-HCl（pH=7.0）溶 液3 mL 和10 mmol/L DDTC 溶液1 mL，混匀，室温避光反应10 min 后测定OD340nm.

1.2.4 TeNRs 的表征仪器 紫外-可见分光光度计(美国贝克曼库尔特有限公司，型号为DU730)、X射线衍射仪(日本株式会社理学，型号为SmartLab 9KW)、透射电子显微镜-能谱(日本电子株式会社，型号JEM-2100)、扫描电子显微镜(日本日立公司，型号REGULUS 8230)和傅里叶红外光谱(德国布鲁克公司，型号Vertex80+Hyperion2000).

1.2.5 TeNRs 的纯化 10 000 r/min 离心10 min，弃上清液，Tris-HCl 重悬沉淀，去离子水离心冲洗3～5 遍，保留沉淀；超声破碎1 h (间隔2 s，超声4 s)后，10 000 r/min 离心10～30 min；沉淀于超低温冰箱冷冻保存1 h，放入冷冻干燥机过夜，研磨成粉末后4 ℃冰箱保存.

1.2.6 TeNRs 催化 PMS 氧化降解Ponceau S，向25 mL 锥形瓶中加入10 mg/L Ponceau S 溶液，再加入0.06 g/L TeNRs 和0.40 g/L PMS 粉末. 在150 r/min、30 ℃恒温气浴振荡，每隔0.5 h，使用0.45 μm 注射器过滤器取出样品，并立即用分光光度计在λmax=520 nm 处测定吸光度，实验设置3 组平行样.

2 结果与讨论

2.1 菌 株 合 成TeNRs菌 株 在 含0.5 mmol/L Te(Ⅳ)平板和还原培养基中好氧培养24 h 后，结果如图1 所示. 在无Te(Ⅳ)的情况下平板和培养基并无颜色变化，表明没有新物质产生；而添加Te(Ⅳ)的平板和培养基的颜色会变黑，Te(Ⅳ)明显被还原为Te(0).

图1 菌还原Te(Ⅳ)的表面特征Fig. 1 Surface characteristics of Te(Ⅳ) reduction by fungus

2.2 TeNRs 的表征取反应后的溶液，将其用去离子水稀释注入石英比色皿中，以去离子水为参比，在200～900 nm 的波长范围内，用UV-Vis 进行全波长扫描. 如图2 所示，发现在210 nm 处有明显的吸收峰，已有文献证实TeNRs 的特征峰是由于表面等离子共振(SPR)[15]，证明TeNRs 的存在.

图2 TeNRs 的紫外-可见吸收光谱Fig. 2 UV-Vis absorption spectra of TeNRs

对样品进行XRD 检测，使用jade 6.5 软件对检测结果进行分析. 如图3，发现在22.99°、27.63°、38.68°、47.01°和51.89°的衍射峰可与Te 的标准卡(ICDD 卡 号36-1452)(100)、(101)、(102)、(200)和(103)面的衍射峰相对应. 这表明TeNRs 成功制备.

图3 TeNRs 的XRD 图谱Fig. 3 The XRD spectra of TeNRs

Baesman 等[16]利用芽孢杆菌(Bacillus)合成棒状TeNRs；在Zare 等[17]的研究中生物合成TeNRs的长度为180 nm. 为了进一步确定纳米粒子的形貌和成分，利用TEM 观察TeNRs 的形貌，如图4(a)所示，细胞壁表面分散着平均长度为100 nm 左右的纳米棒，推测其为Te(Ⅳ)的还原产物. 为了进一步表征纳米粒子，对样品进行如图4(b)的HRTEM 分析，结果表明纳米粒子晶格条纹的间距约为0.21 nm，对应TeNRs 的(102)晶格平面. 对图4(a)中标示的纳米棒进行EDS(图5)分析，发现单质Te 在3.6 keV下有一个显著峰值，观测到C，N，O 的峰，推测源于生物分子，如酶、菌生物材料或包裹在TeNRs 上的多糖和蛋白质[18]，此外Cu 产生的峰值是由于纳米粒子滴于铜网上造成. 从SEM (图6)可看出大量纳米棒位于细胞壁表面，这与TEM 结果一致. 这些结果进一步证实TeNRs 的存在.

图4 TeNRs 透射电子显微镜图和高分辨透射电子显微镜图Fig. 4 TEM picture and HRTEM picture of TeNRs

图5 TeNRs 的EDS 图谱Fig. 5 Energy spectrometer of TeNRs

图6 TeNRs 扫描电镜图像Fig. 6 SEM picture of TeNRs

图7 给出的FTIR 光谱用来分析TeNRs 表面的有机官能团: 3 382 cm-1处吸收峰(O―H 伸缩)，2 926 cm-1(C―H 反对称伸缩)，2 854 cm-1(C―H 对称伸缩)，1 749 cm-1(C＝O 伸缩)，1 652 cm-1(C＝C伸缩)，1 415 cm-1(COO―对称伸缩)，1 235 cm-1(多糖 和 磷 脂 中 的P＝O 伸 缩)、1 077cm-1(肽 聚 糖C―O 和 P―O 伸缩). 结果表明，生物合成 TeNRs表面附着蛋白质、多糖等物质.

图7 TeNRs 的傅里叶红外光谱Fig. 7 The FTIR spectra of TeNRs

2.3 TeNRs 催化PMS 氧化降解Ponceau S保持Ponceau S 投 加 量 为10 mg/L，TeNRs 投 加 量 为0.06 g/L，PMS 投加量为0.40 g/L 的条件不变.

(1)Ponceau S 颜色在不同体系下的变化如图8(a)所示，单独加PMS 或只有染料存在时，染料颜色基本不会改变；单独加TeNRs 时，染料颜色会加深；而对比加入TeNRs 和PMS 时，染料颜色会逐渐发生改变，最终由红色变为白色.

(2)Ponceau S 颜色在不同体系下降解曲线如图8(b)所示，4 种体系下Ponceau S 的降解速率比较：v(TeNRs+PMS +Ponceau S) ＞v(PMS+Ponceau S)＞v(TeNRs+Ponceau S) ≈v(Ponceau S). 单 独 加TeNRs 对Ponceau S 基本不会吸附；单独加入PMS对Ponceau S 有一定的降解效果，但其最终降解率在6.61%；而对比加入TeNRs 催化PMS 对Ponceau S 的降解效果较为显著，降解率可达92.5%.

图8 TeNRs 催化降解Ponceau S 性能实验Fig. 8 Catalytic degradation of Ponceau S by TeNRs

由上述可知单独加入TeNRs 时，对Ponceau S颜色及降解率的影响基本忽略不计，说明Ponceau S 降解并非吸附作用造成；PMS 可降解Ponceau S是因其本身的氧化性，但其颜色变化和降解率不明显；当同时加入 PMS 和TeNRs 后，Ponceau S 的颜色变化显著、降解率大大增加，说明TeNRs 可提供催化活性位点以活化PMS 产生强氧化性自由基[19]，故生物合成的TeNRs 具有良好的催化PMS 氧化降解Ponceau S 的能力.

2.4 降解机制的分析实验采用L-组氨酸、叔丁醇、乙醇和苯酚来猝灭催化降解过程中可能产生的自由基.L-组氨酸主要猝灭单线态氧（1O2）[19]；乙醇和苯酚常用猝灭HO·和SO4-·；叔丁醇对HO·有比较高的反应速率，常用来猝灭HO·. 实验结果如图9 所示，当TeNRs+PMS+Ponceau S 体系添加500 mmol/L 的乙醇后，Ponceau S 降解率从92.5%下降为52.6%；添加1 mmol/L 的L-组氨酸和500 mmol/L的叔丁醇后有轻微抑制Ponceau S 降解的作用；加入500 mmol/L 的苯酚后，Ponceau S 的降解率降为34.6%.

图9 自由基猝灭实验Fig. 9 Free radical quenching experiment

推测产生这种现象的原因可能是L-组氨酸、叔丁醇、乙醇和苯酚的水溶性不同，对液相和催化剂表面的自由基及非自由基清除效果不同[20].L-组氨酸，乙醇和叔丁醇都是亲水性化合物，相对难以接近催化剂表面，大部分会在液相中与污染物分子竞争自由基，所以当3 种化合物加入反应体系后，降解率会出现不同的降低情况，结合猝灭剂会清除特定自由基可知：在反应过程中产生的自由基有SO4-·、HO·以及非自由 基1O2，但主要产生的是SO4-·. 而苯酚属于疏水性化合物，会更容易接近催化剂表面，从而高效清除催化剂表面的自由基[21]，由结果现象看苯酚的抑制作用最为强烈，分析催化剂表面具有大量的SO4-·. 由此可知TeNRs在催化PMS 降解Ponceau S 的过程中，无论在催化剂表面还是液相，SO4-·都起到了主要作用.

为了进一步分析Ponceau S 的降解机制，实验采用UV-Vis 全波长扫描(图10)对不同时间段TeNRs+PMS+Ponceau S 的反应体系进行扫描以考察染料在降解过程中的结构变化.Ponceau S 在可见区域520 nm 处有1 个强的吸收峰，即偶氮键(―N＝N―)与萘环共轭发色体系的吸收峰，近紫外区259 nm 处吸收峰对应苯环、萘环或杂环不饱和体系[22]. 随着反应的进行，520 nm 和259 nm 处吸收峰逐渐降低，分别对应偶氮键断裂和苯环、萘环开环等反应.

图10 Ponceau S 的紫外-可见吸收光谱Fig. 10 UV-Vis absorption spectra of Ponceau S

根据自由基猝灭的结果可知，在TeNRs 催化PMS 降解Ponceau S 的过程中，SO4-·起到了主要作用，而且结合不同时间降解产物的紫外-可见光谱推测染料Ponceau S 主要的降解机制是由于TeNRs表面丰富的电子转移过程使其活化PMS 的能力增强，产生的SO4-·破坏了染料的偶氮键、苯环和萘环结构，从而导致Ponceau S 的降解.

3 结论

本 文 利 用Meyerozyma guilliermondii还 原Te(Ⅳ)，通过分析XRD、TEM-EDS、SEM 和FTIR，证明TeNRs 的成功合成. TeNRs 催化PMS 降解Ponceau S 的实验结果表明：TeNRs 可提供催化活性位点以活化PMS 降解Ponceau S，4 h 降解率达到92.5%；并且通过自由基猝灭实验发现，整个体系中，SO4-·起到了主导作用，从而导致Ponceau S的降解. 故TeNRs 具有良好的催化PMS 氧化降解Ponceau S 的能力，这也为生物化学联合处理偶氮染料提供了新的催化策略.