针刺治疗对膀胱过度活动症大鼠膀胱功能及膀胱黏膜组织P2X3蛋白表达的影响

王丽娟 冯琦钒 程亚伟 丁一 陈磊

(海南省中医院，海南 海口 570203)

膀胱过度活动症(OAB)是一种膀胱功能障碍综合征，在2002年国际尿控协会(ICS)正式提出这一概念，其主要以尿急症状为特征，伴有或不伴有尿失禁，通常还表现为白天尿频和夜尿症〔1〕。有研究〔2〕表明，膀胱黏膜组织配体门控性非选择性阳离子通道受体(P2X)3蛋白的表达能够影响膀胱节膀胱逼尿肌等相关功能和OAB疾病的发生。针刺在治疗OAB中已有过应用，并且有一定的治疗效果。本研究即采用针刺中髎穴、次髎穴治疗膀胱过度活动症大鼠，探究其对大鼠膀胱功能及膀胱黏膜组织P2X3蛋白表达的影响，为今后有关针刺治疗OAB研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 30只SD雄性大鼠，2～3月龄，体重220～240 g。采用12 h恒定昼夜交替光照，相对湿度50%～70%，温度22～26℃的饲养条件，自由饮食饮水，适应性饲养1 w后，将30只大鼠按随机数字表法分为3组：对照组、模型组、针刺组，每组10只。在整个实验过程中对动物的处置均遵照中华人民共和国科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》中的相关条款。

1.2主要仪器和试剂 Spike8.0数据采集分析系统购自上海骐驰有限公司;Warner差分放大器DP-301 ADInstruments公司；RNA提取试剂Trizol、RNA逆转录试剂盒、SYBR@Green RT-PCR试剂盒均购自美国Sigma-Aldrich公司；P2X3单克隆抗体(货号：PA5-30894)及相应二抗均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.3建立膀胱过度活动症大鼠模型 参照文献〔3〕的方法，对模型组与针刺组的大鼠采用近端尿道结扎法，建立膀胱流出道梗阻(BOO)诱导的OAB 模型。OAB模型建立的具体方法为：采用2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位固定，常规消毒尿道口及四周。用直径1 mm硬膜外导管从尿道插入膀胱，取下腹部正中切口，切开皮肤及皮下组织，剪开腹直肌前鞘，小心分离腹直肌，找到膀胱，游离膀胱尿道交界处，以3-0丝线结扎近端尿道，结扎松紧度以线结贴紧尿道，探子又可轻易拔出为宜。拔出导管，将膀胱置回原位，使用适量抗生素，缝合切口。对照组大鼠采用除结扎尿道外同样的手术操作，对每只手术后的实验大鼠单独饲养，保持动物笼清洁干燥。

1.4针刺治疗 取穴：中髎/次髎穴：位于骶部，S2、S3棘突间隙正中旁开约5 mm。大鼠有3对骶后孔，且影响排尿功能主要以第2骶神经为主，大鼠第2骶后孔相当于人的中髎穴和次髎穴。针刺手法：采用0.20 mm×25 mm毫针，对实验大鼠采用深刺，垂直刺入S2骶后孔，约15 mm，其中电针参数设置为：强度1 mA，频率2 Hz，连续波，仅对针刺组大鼠进行持续刺激5 min。电针治疗后继续用0.9% 氯化钠注射液进行膀胱灌注。

1.5针刺治疗对膀胱功能的影响 在大鼠膀胱顶部插入静脉留置针，通过Spike8.0软件测量收集实验大鼠的尿动力学数据。具体参数设置如下，20 kHz采样频率，10 kHz Warner差分放大器低通滤波，300 Hz高通滤波。通过三通阀使外导管与压力感受器和微量灌注泵连接，排空小便后，向膀胱缓慢充满常温生理盐水。将系统压力在外导管与大气相通状态下调零，打开Spike8．0软件收集记录针刺干预后膀胱基压、最大逼尿肌收缩压、膀胱收缩时间、收缩后膀胱内压、排尿间隔时间等相关数据。

1.6膀胱黏膜组织P2X3 mRNA的表达 在完成膀胱功能相关指标收集之后，立即处死大鼠，收集膀胱组织，在预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)中洗净后将其剪成碎片，分成两份。取其一用Trizol法提取总RNA，根据逆转录试剂盒说明书合成cDNA，应用SYBR Green实时荧光定量PCR法，对miR-21的表达进行荧光定量分析。热循环反应条件为：95℃预变性10 min，95℃变性30 s、60℃退火90 s、72℃延伸90 s共40个循环。运用7500 System Software分析结果，得出各组内参基因和目的基因Ct值。

1.7膀胱黏膜组织P2X3蛋白表达 取膀胱黏膜组织碎片，加入适量RIPA裂解液提取总蛋白，并采用二喹啉甲酸(BCA)法对蛋白进行定量。取30 μg待测样本蛋白进行Westen印迹。具体操作方法如下：在10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，把凝胶转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，加入5%脱脂奶粉封闭2 h后加入工作浓度1∶1 000的P2X3抗体后在4℃冰箱孵育过夜。再用PBS漂洗3次后，加入相应的二抗孵育2 h后，即可在暗室中X线曝光、显影，利用Quality One对蛋白条带灰度进度分析，以β-actin为内参计算样本蛋白相对表达量。

1.8统计学方法 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析、LSD检验、Pearson相关分析。

2 结 果

2.1针刺治疗对膀胱功能的影响 与模型组相比较，对照组、针刺组的膀胱基压和收缩后膀胱内压均显著降低(均P<0.05)，最大逼尿肌收缩压、膀胱收缩时间和排尿间隔时间均显著升高(均P<0.05)；且与对照组相比较，针刺组的膀胱基压和收缩后膀胱内压均显著升高(均P<0.05)，最大逼尿肌收缩压、膀胱收缩时间和排尿间隔时间均显著降低(均P<0.05)。见表1。

表1 各组膀胱功能及P2X3 mRNA和蛋白表达比较

2.2膀胱黏膜组织P2X3 mRNA的相对表达量 3组膀胱黏膜组织P2X3 mRNA的相对表达量差异无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

2.3膀胱黏膜组织P2X3蛋白表达 与模型组相比较，对照组和针刺组的P2X3蛋白相对表达量均显著降低(均P<0.05)，且与对照组相比较，针刺组的P2X3蛋白相对表达量显著升高(P<0.05)。见表1、图1。

2.4膀胱组织P2X3蛋白表达与膀胱功能相关性分析 膀胱基压和收缩后膀胱内压与P2X3蛋白相对表达量呈正相关(r=0.676、0.383，均P<0.05)，最大逼尿肌收缩压、膀胱收缩时间和排尿间隔时间与P2X3蛋白相对表达量呈负相关(r=-0.722、-0.762、-0.794，均P<0.05)。

图1 各组膀胱黏膜组织P2X3蛋白表达

3 讨 论

全球有12%左右的人口受到OAB的影响，其中女性患病率略高于男性，40岁以上人群发病率约为40岁以下人群发病率的十倍〔4，5〕。目前针对OAB有多种治疗方案，包括改变生活方式的行为治疗、药物治疗、手术治疗、神经调节和中医药治疗。西医治疗多采用抗胆碱能药物，通过拮抗M受体，减少逼尿肌不自主收缩，改善膀胱感觉功能及抑制逼尿肌不稳定收缩可能，但同时副作用明显，特异性较差〔6〕。而有研究表明神经调节对药物治疗无效的OAB患者有显著治疗效果〔7〕。

OAB在中医学并没有完全对应的概念，但与“淋证”“小便不禁”等相关概念有一定的联系。针刺治疗对膀胱的影响主要表现为调节膀胱的紧张度，解除尿道括约肌痉挛，进而达到治疗OAB的目的。根据传统经络理论，针刺中髎穴、次髎穴能激发膀胱经气，促进膀胱气化〔8〕。研究〔9～12〕表明，针刺中髎穴、次髎穴能够改善膀胱功能，在OAB临床治疗中具有操作便捷，副作用小等优势，同时取得了令人满意的疗效。

本实验结果表明针刺治疗能够有效改善膀胱功能，对于治疗OAB有明显疗效，这与莫倩等〔10〕的研究有着类似的结果。P2X3蛋白主要在膀胱黏膜层和黏膜下层表达，作为受体在调控膀胱功能有着重要的作用。研究发现〔13〕，敲出P2X3蛋白基因小鼠的膀胱感受功能受明显影响，表现为明显的排尿间隔时间增长和排尿频次下降，而在P2X3蛋白过表达的小鼠中，过量的P2X3能通过C类传入神经纤维促进膀胱过度活动。本研究结果显示正常大鼠和经针刺治疗OAB大鼠的膀胱黏膜组织P2X3蛋白表达水平均降低，这一结果此前研究有类似结果〔14，15〕。此外，本研究Pearson分析结果提示膀胱组织P2X3蛋白过表达可能影响膀胱功能，推测OAB模型大鼠膀胱组织P2X3蛋白异常高表达，增加膀胱基压和收缩后膀胱内压，降低了最大逼尿肌收缩压、膀胱收缩时间和排尿间隔时间；同时因为在各组mRNA无明显差异的情况下，而P2X3蛋白在OAB模型大鼠中出现明显升高，这说明P2X3蛋白的表达可能受到翻译水平或是其对mRNA转录的负反馈的调节。