基于网络药理学探讨人参治疗骨质疏松的作用机制

刘震坤 张兆鹏 胡博 白金萍 郭军鹏

(1吉林省中医药科学院，吉林 长春 130021；2长春中医药大学)

骨质疏松(OP)是由激素失调、营养不良、免疫功能紊乱、遗传等引起的骨退行性疾病，但究竟何种因素是主要原因及其作用机制还有待于进一步研究证实〔1〕。因此，OP已被WHO列为三大老年病之一。治疗原则是早发现、早预防、早治疗，尽量避免骨折等严重并发症的发生。早期发现与预防及发病后的综合性治疗是OP防治的关键〔2〕。现代医学对OP病因、发病机制和治疗进行了大量研究，但防治效果仍不理想〔3〕。OP的症状和体征与中医“骨痿”“骨枯”“骨痹”等描述比较相似，主要由肾精亏虚、脾胃虚弱等引起，治则以补肾、填精、益髓为根本〔4～7〕。人参是补虚中药典型代表，临床常用其强身健体、延缓衰老。本研究基于网络药理学技术，筛选人参有效成分和抗OP靶点基因，构建人参抗OP靶点基因和其编码蛋白的网络结构图，富集分析了人参有效成分治疗OP的核心靶点基因及信号通路，为人参的现代化研究与开发提供理论依据。

1 材料和方法

1.1人参中有效成分的筛选和靶点的预测 在中药系统药理学分析和预测平台(TCMSP)检索“人参(Ginseng)”，以口服利用度(OB)>30%，药物类药性(DL)>0.18为筛选条件，对人参有效成分进行筛选。然后借助TCMSP在线药物成分靶点预测和Perl语言，对人参主要成分的作用靶点进行预测。利用UniProt数据库对筛选出的有效靶点进行基因名的添加。如果在数据库中找不到相应的靶点基因名，则视为不存在或无效靶点。

1.2获取OP靶点基因 在GeneCards数据库、OMIM数据库检索“Osteoporosis(骨质疏松)”，整理所得疾病靶点相关基因，得到OP靶点基因。

1.3人参靶点基因与OP靶点基因交集 通过R语言软件获得中药-OP共同靶点基因，结果以Venn图呈现。

1.4人参-OP靶点基因调控网络 借助Perl语言映射人参-OP共同靶点基因，应用Cytoscape可视化软件得到人参-OP调控网络图，其中各个节点包括人参、人参有效成分、人参靶点基因、OP靶点基因、人参-OP共同靶点基因。

1.5构建蛋白互作网络图 通过STRING数据库构建人参-OP靶点基因编码蛋白与其他蛋白相互作用的网络(PPI)。利用R语言处理STRING数据库所得文件，得到蛋白互作网络相关核心基因的条形图，同时获得核心靶点基因名称。

1.6GO和KEGG通路富集分析 用R语言将中药-疾病共同靶点基因进行处理计算，通过DAVID数据库进行GO富集分析，对共同靶点基因从位置、功能和参与生物学过程等方面进行分类和阐释，靶点基因参与的生物学过程以坐标气泡图呈现。KEGG通路富集分析结果取P<0.05前Top20的信号通路。

2 结 果

2.1人参有效成分及相关靶点筛选 通过TCMSP数据库检索，根据OB和DL参数筛选人参主要有效成分，共计22种，见表1。

2.2中药靶点基因和疾病靶点基因交集 由Venn图得到4 659个疾病相关靶点基因，52个中药相关靶点基因，共同作用靶点基因34个。

2.3中药-疾病调控网络构建 用Cytoscape可视化软件可得到中药疾病调控网络图，见图1。八边形代表OP，箭头代表中药人参，六边形代表人参的有效成分，圆形代表人参-OP共同靶点基因。

表1 通过TCMSP数据库筛选人参主要有效成分

图1 中药-疾病-靶点调控网络

2.4人参-OP靶点基因编码蛋白互作网络分析 PPI中与其他节点联系较多的节点，即是核心靶点基因蛋白。条形图显示主要有：丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)8、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)3、RELA基因、细胞间黏附分子(ICAM)1、细胞色素P450超家族(CYP)基因等，见图2、3。

图2 人参治疗OP的靶点基因蛋白互作网络

2.5GO富集分析 GO富集分析GO富集显示人参治疗骨质疏松核心靶点基因在生物活性方面主要集中在：有机物质的反应、细胞死亡的调节(包括凋亡等)；在细胞成分方面主要集中在细胞质中的成分；在细胞核功能方面主要集中在转录调节活性方面，见图4。

图3 蛋白互作网络核心基因条图

图4 GO富集坐标气泡图

2.6KEGG通路富集分析 人参治疗OP的信号通路主要涉及：肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、核因子(NF)-κB信号通路、癌症相关信号通路、乙型肝炎相关信号通路、MAPK信号通路、化学致癌相关信号通路、弓形虫NOD样受体信号通路等，见图5和6。

图5 KEGG功能富集分析柱状图

图6 KEGG富集气泡图

3 讨 论

本研究从TCMSP数据库筛选获得人参治疗OP的有效活性成分22个，人参-OP共同作用靶点基因34个，其中核心靶点基因有MAPK家族基因、CYP家族基因、caspase-3基因、RELA基因、ICAM1基因等，GO和KEGG Pathway富集分析发现这些基因主要通过TNF信号通路、NF-κB信号通路、癌症相关信号通路等信号通路影响核受体活性、类固醇激素受体活性、肽链内切酶活性而影响OP的发生和发展。TNF-α与其受体结合通过多条信号通路参与细胞生理功能的调节〔8〕。TNF-α对骨代谢具有双向调节作用，主要取决于TNF-α浓度和应答反应的细胞所处分化阶段。TNF-α与RANKL能够通过不同信号通路激活NF-κB而促进破骨细胞的分化和成熟。TNF-α通过抑制Runx2和成骨细胞相关转录因子、上调Smurf1表达而抑制成骨细胞与前体细胞的分化和成熟〔9〕。有研究表明，低浓度TNF-α能够诱导BMSCs中BMP-2的表达，加快成骨细胞的产生，提高碱性磷酸酶(ALP)水平而促进细胞外基质的矿化，对OP的治疗起促进作用〔10〕。MAPK是成骨细胞分化的正调节因子，能够增强ALP的表达，促进骨组织钙化。MAPK信号通路还能够激活成骨细胞分化必需因子Runx2的表达而促进骨形成〔11〕。

综上，人参有效成分治疗OP并不是通过单一基因或者单一信号通路的作用，而是多个基因和多个信号通路共同作用的结果。本研究筛选和富集了人参治疗OP可能的靶基因和信号通路，为今后研究人参治疗OP提供新的方向和思路。