高效液相色谱法测定参芪几丁聚糖胶囊中特女贞苷含量

董 磊，沙丽颖，杨 雪，张 辉

（青岛大学附属医院，山东266000）

参芪几丁聚糖胶囊为本院医院制剂，由女贞子、黄芪、党参、白花蛇舌草、半枝莲、几丁聚糖等多味中药组成，具有滋阴补气、解毒散瘀等功效，临床用于防治肿瘤患者放化疗引起的副作用，提高肌体免疫力，修复各种理化损伤。处方中女贞子为主要成分，《神农本草经》言其主补中，安五脏，养精神，除百疾，久服肥健。将其列为补益药之上品。女贞子含有多种化学成分，主要有环烯醚萜类、三萜类、黄酮类、挥发油、多糖类、苯乙醇苷、脂肪酸、氨基酸和微量元素等。现代药理研究表明，女贞子具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、免疫调节、延缓衰老、保肝护肝、降糖降脂、抗病毒等多种药理作用［1］。女贞子中含有的齐墩果酸、特女贞苷为测定女贞子含量的常用指标成分。本文参考《中国药典》2020版将特女贞苷作为参芪几丁聚糖胶囊中女贞子含量测定的指标成分。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪Waters 1525，2487紫外检测器（美国沃特世公司）；GR-202电子分析天平（日本AND公司）。特女贞苷对照品（批号为11926-201906，含量以95.0%计，中国食品药品检定研究院）；参芪几丁聚糖胶囊（0.33 g/粒，批号20201009、20201112、20201210，青岛大学附属医院）；甲醇（色谱纯，德国merk公司）；水为自制超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用高效液相色谱法，色谱柱为Waters Symmetry C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-水（40∶60）为流动相，检测波长为224 nm，柱温为35℃，流速为1.0 ml/min，进样量为10 μl。

2.2溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取特女贞苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含0.25 mg的特女贞苷对照品储备液，精密量取储备液2 ml置10 ml量瓶中，加40%甲醇溶解至刻度，摇匀，即得对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品细粉2 g，精密称定，置50 ml量瓶中，加40%甲醇适量，超声30 min，放冷至室温，加40%甲醇至刻度，摇匀，滤过，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 按参芪几丁聚糖胶囊处方及制剂工艺，制成缺女贞子的阴性样品。按“2.2.2”项下方法制备阴性样品溶液，即得。

2.3 专属性试验 取“2.2”项下特女贞苷对照品溶液、供试品溶液（批号为20201009）和阴性样品溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果供试品溶液色谱图中呈现与特女贞苷对照品保留时间一致的色谱峰，各成分之间分离度良好，无杂质峰干扰，阴性样品对待测成分特女贞苷无干扰。表明在此色谱条件下，该方法的专属性良好,理论板数按特女贞苷峰计算大于4 000，分离度大于1.5。见图1。

图1 对照品（A）

2.4 线性关系考查 分别精密量取对照品储备液0.1、0.5、1、2、3和5 ml于10 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，得含特女贞苷浓度分别为2.5、12.5、25、50、75和125 μg/ml的对照品溶液，分别精密量取10 μl，注入液相色谱仪，记录色谱峰。以特女贞苷对照品的质量浓度为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程为Y=11 204 X+8 730.7（r=0.999 9）。结果表明特女贞苷质量浓度在2.5～125 μg/ml范围内，浓度与峰面积线性关系良好。

2.5 精密度试验 精密吸取“2.2.1”项下特女贞苷对照品溶液10 μl，重复进样6次，测定并记录色谱峰面积，结果平均峰面积RDS为1.1%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取同一批号样品（批号为20201009），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12和16 h进样，记录色谱峰面积，结果平均峰面积RSD为1.7%（n=6），表明供试品溶液在16 h内稳定。

2.7 重复性试验 取同一批号样品（批号为20201009）2 g，6份，分别置50 ml量瓶中，加40%甲醇适量，超声30 min，放冷至室温，加40%甲醇至刻度，摇匀，滤过，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液摇匀作为供试品溶液。另取特女贞苷对照品25 mg，置100 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，作为对照品储备液，精密量取储备液2 ml置10 ml量瓶中，加40%甲醇溶解至刻度，摇匀，即得对照品溶液。精密量取上述溶液各10 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。每粒样品中特女贞苷的平均含量为119.8 μg，RSD为1.6%（n=6）。

2.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的参芪几丁聚糖胶囊样品（批号为20201009）9份，每份约1 g，精密称定，分别加对照品储备液1.1、1.4和1.7 ml，制成高、中、低3个浓度的供试品溶液，每个浓度重复3份。按“2.2.2”项下方法制成供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算回收率，结果平均回收率为99.6%，RSD为0.2%。见表1。

表1 加样回收率试验结果（n=9）

2.9 样品测定 取不同批号的样品，按照“2.2.2”项下方法制成供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进行测定，计算，结果见表2。

表2 3批样品含量测定结果

3 讨论

3.1 流动相的选择 参照《中国药典》2020年版一部女贞子中特女贞苷的含量测定方法及参考文献［2-6］，分别考查了0.1%磷酸水-乙腈、乙腈-水、甲醇-水等不同流动相，试验结果表明甲醇-水（40∶60）分离效果较好。

3.2 提取条件的选择 预试验对特女贞苷提取时间（20、30、50和60 min）进行了考查，结果发现超声提取30 min可提取完全，方法简便、易行、效率高，有利于节约实验室的人力、物力，因此提取方法确定为超声30 min。

3.3 耐用性考查 分别考查不同批号色谱柱、不同流速（1和0.8 ml/min）、不同柱温（35和30℃）、不同甲醇比例（40%和45%）色谱条件下的耐用性。按外标法以峰面积计算本品的含量。结果显示，色谱条件发生微小变化对检测结果无影响，该方法耐用性良好。

参芪几丁聚糖胶囊原质量标准未对女贞子指标成分进行测定，本文通过查阅文献，采用高效液相色谱法，测定参芪几丁聚糖胶囊中特女贞苷的含量，建立了参芪几丁聚糖胶囊的含量测定方法。结果显示该方法操作简便，结果可靠准确，重现性好，为提高参芪几丁聚糖胶囊的质量标准提供参考，为更加全面地评价参芪几丁聚糖胶囊的质量提供科学依据。