N-取代苯基-5-三氟甲基-4-吡唑酰胺类化合物的合成及抗植物真菌生物活性研究

吴志兵 牛雪 杨晶欣 谢德文 张承志

摘 要：吡唑酰胺类化合物是一类具有独特作用机制的化合物，为了发现更高活性的吡唑酰胺类化合物，设计并合成了9个结构新颖的N-取代苯基-5-三氟甲基-4-吡唑酰胺类化合物。采用生长速率法，测试了化合物对5种植物病原真菌：小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）、辣椒枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、茄子黄萎病菌（Verticillium dahliae）、水稻纹枯病菌（Thanatephorus cucumeris）和油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）的抑制活性。初步生物活性表明：在100 μg/mL浓度下，部分目标化合物对测试真菌有一定的抑制作用，其中化合物5d对茄子黄萎病菌和水稻纹枯病菌的抑制率分别为51.5%和65.8%，为进一步结构优化提供参考。

关键词：吡唑酰胺;合成;抗真菌活性

中图分类号： TQ450.21

文献标志码：A

自2009年国际真菌剂抗性行动委员会（fungicide resistance action committee，FRAC）首次将具有抑制琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase， SDH）的酰胺类化合物命名为琥珀酸脱氢酶抑制剂（succinate dehydrogenase inhibitors， SDHIs）以来，已有23个商品化的杀菌剂面市[1-3]。随着越来越多的商品化的杀菌剂应用到实际生产中，该类化合物的抗性问题也日渐凸显出来[4-6]。而如何在原有的结构基础上，设计出结构新颖且无交互抗性的化合物也成为了当前科研人员所面临的挑战。

通过对商品化的琥珀酸脱氢酶抑制剂的结构分析发现，有10个是吡唑酰胺类化合物。所有吡唑酰胺类化合物中，吡唑环的“1-位”的取代基均为“甲基”，而在吡唑环的“3-位”具有“CHF2”或“CF3”取代基的有6个;在“3-位”和“5-位”同时具有2个取代基的有4个;但是没有一个吡唑酰胺类化合物是仅有“5-位”取代的[7-8]。本课题组基于此分析，在前期的工作中设计合成了系列1-取代-5-三氟甲基-4-吡唑酰胺类化合物，生物活性测试结果表明该类化合物表现出良好的抗植物病原真菌活性[8-11]。

为了寻找高效、低毒、广谱且作用机理独特新颖的吡唑酰胺类杀菌剂，在课题组前期工作基础上[8]，保留了吡唑环“1-位”和“5-位”的取代基，而将“酰胺”胺部分的“吡啶基”替换为“取代苯基”，设计并合成了9个N-取代苯基-5-三氟甲基-4-吡唑酰胺类化合物，对所有目标化合物进行了抗植物真菌的生物活性测定，期望发现更高活性的吡唑酰胺类化合物，为新农药的创制及衍生工作提供一定的基础依据。

1 实验部分

1.1 合成路线

目标化合物的合成路线如图1所示。

1.2 仪器与试剂

1H NMR、13C NMR和19F NMR数据由Bruker Biospin AG-400型核磁共振仪（瑞士Bruker公司，TMS为内标，DMSO-d6为溶剂）测定，熔点由X-4型显微熔点测定仪（郑州南北仪器设备有限公司，温度计未校正）测定。所用试剂和溶剂均为市售化学纯或分析纯，使用前经常规处理，其中四氢呋喃经金属钠除水处理。

1.3 供试真菌和对照药剂

植物真菌：小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）、辣椒枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、茄子黄萎病菌（Verticillium dahliae）、水稻纹枯病菌（Thanatephorus cucumeris）和油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）购于北京北纳创联生物技术研究院。

对照药剂：萎锈灵（98%原药，阿拉丁试剂上海有限公司）。

1.4 中间体的制备[8，12]

1.4.1 中间体2的合成

在带有冷凝管、温度计的250 mL三口瓶中，依次缓慢加入三氟乙酰乙酸乙酯 （9.2 g， 0.05 mol），原甲酸三乙酯 （23.2 g， 0.10 mol）和醋酸酐 （15.3 g， 0.15 mol），加熱至100 ℃，反应12 h， 薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC）检测反应结束，降至常温，减压蒸馏出溶剂及过量的原甲酸三乙酯，剩余物未经纯化直接溶于100 mL无水乙醇，苯肼 （6.0 g， 0.55 mol）缓慢加入反应液中，加热回流5 h，TLC检测反应结束，旋转蒸发除去溶剂，加入水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，除去有机溶剂，粗产品经柱层析（乙酸乙酯/石油醚=1/20）分离纯化得中间体2，黄色油状物，收率 72%。1H NMR （DMSO-d6） δ： 8.31 （s， 1H， pyrazole H）， 7.63～7.54 （m， 5H， benzene H）， 4.32 （q， J=7.2 Hz， 2H， CH2）， 1.31 （t， J=7.2 Hz， 3H， CH3）。

1.4.2 中间体3的合成

在带有冷凝管和温度计的250 mL三口瓶中，加入中间体2（8.5 g， 0.03 mol），四氢呋喃 （40 mL）， H2O （40 mL），搅拌下缓慢加入无水氢氧化锂（2.86 g， 0.12 mmol）， 加热至70 ℃，反应4 h， TLC检测反应结束，旋转蒸发除去四氢呋喃，反应液冷却，1 mol/L的盐酸溶液调节反应液的pH至4，析出大量固体，过滤，固体用水洗涤，干燥后得中间体3，黄色固体，收率92%，熔点191～192 ℃。1H NMR （DMSO-d6） δ： 13.38 （s， 1H， COOH）， 8.25 （s， 1H， pyrazole H）， 7.62～7.53 （m， 5H， benzene H）。

1.4.3 中间体4的合成

中间体酰氯4由中间体3在二氯亚砜中回流4 h制得。

1.5 目标化合物5a—5i的合成[9-11]

在25 mL的反应瓶中，加入取代苯胺 （1 mmol）和10 mL干燥的四氢呋喃，冰浴下分别缓慢加入80% NaH （1.5 mmol）和中间体4（1 mmol），升温至室温，反应10 h，TLC检测结束反应，旋转蒸发除去溶剂，残留物溶解至乙酸乙酯中，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，粗产物经柱层析（乙酸乙酯/石油醚=1/15～1/30） 纯化，得到目标化合物5。目标化合物5a—5i的结构及理化数据见表1。

1.6 抑菌活性测试

采用菌丝生长速率法[8]测定了目标化合物对小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）、辣椒枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、茄子黄萎病菌（Verticillium dahliae）、水稻纹枯病菌（Thanatephorus cucumeris）和油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）的抑制活性，具体实验方法如下。

PDA培养基的配制：称取800 g去皮土豆，煮汁后过滤，加入琼脂80 g、葡萄糖80 g，混匀溶解后以每瓶90 mL转移到200 mL锥形瓶中，封口后在120 ℃条件下高压灭菌30 min，冷却后备用。

药液的配制：称取待测化合物10 mg溶解到1.0 mL DMSO中，在无菌超净台中转移至含9.0 mL无菌吐温水的15 mL离心管中，再加到已灭菌的90 mL PDA培养基中混匀，使得药液最终浓度为100 μg/mL，将培养基平均倒入9个培养皿中冷却备用，以等量的DMSO吐温水作为空白对照，以商品药萎锈灵作为对照药剂。

抑菌活性测试：取提前活化好的真菌边缘打孔制成直径为4.0 mm的菌饼，用无菌接种针移接到含药培养基中央，置于28 ℃的恒温培养箱中培养2～6 d。待空白对照组菌落长到6.0 cm左右时，用直尺按十字交叉法测量菌丝直径。根据公式计算抑制率，计算公式如下：

I =（C-T）/（C-0.4）×100%

式中：I为抑制率;C为空白对照菌丝测量直径，cm;T为药物处理组测量直径，cm。

2 结果与讨论

2.1 合成

以三氟乙酰乙酸乙酯和原甲酸三乙酯为原料，与苯肼闭环生成1-苯基-5-三氟甲基-4-吡唑酸乙酯2，在无水氢氧化锂的条件下，脱酯，生成1-苯基-5-三氟甲基-4-吡唑甲酸3，以二氯亚砜为溶剂和反应试剂制得吡唑甲酰氯4，与不同的取代苯胺反应得到目标化合物5a—5i，产率为55%～79%。其中，吡唑甲酰氯4的制备中，二氯亚砜需重蒸后使用，否则会影响下一步反应的产率;而目标化合物的合成过程中，溶剂为已除水的四氢呋喃，碱是NaH，若溶剂中含水则反应产率会明显降低。

2.2 生物活性测试

采用离体生长速率法，在100 μg/mL的浓度下对目标化合物进行5种植物病原真菌的抑菌活性测试，测试结果如表2所示。

生物活性测试结果表明：当“酰胺”键的胺部分由“取代吡啶基”替换为“取代苯基”后，大部分目标化合物对所测试的5种植物病原真菌的抑制活性明显下降;但化合物5d对茄子黄萎病菌和水稻纹枯病菌依然保持了一定的抑菌活性，在100 μg/mL的浓度下，对这2种植物病原真菌的活性分别为51.5%和65.8%，均低于对照药剂萎锈灵（98.7%和88.3%）。结构分析发现，在苯基的邻位引入“甲硫醚”结构后，化合物5d依然保持了一定的抑制真菌活性。

3 结果与讨论

以三氟乙酰乙酸乙酯和原甲酸三乙酯为原料，设计、合成了一系列N-取代苯基-5-三氟甲基-4-吡唑酰胺类化合物。对目标化合物的抗植物病原真菌测试结果表明：当“酰胺”键的胺部分替换为“取代苯基”后，大部分目标化合物对所测试的5种植物病原真菌的抑制活性明显下降;但在苯基的邻位引入“甲硫醚”结构后，化合物5d对茄子黄萎病菌和水稻纹枯病菌依然保持了一定的抑菌活性。在100 μg/mL的浓度下，化合物5d对这2种植物病原真菌的活性分别为51.5%和65.8%，均低于对照药剂萎锈灵（98.7%和88.3%）。该研究为下一步结构优化提供了一定基础。

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（责任编辑：周晓南）

Abstract：

Pyrazole carboxamide is a series of compounds with a unique mechanism of action. In order to discover higher activity compounds， nine novel N-substituted-1-phenyl-5-trifluoromethyl-1H-pyrazole-4-carboxamide derivatives were designed and synthesized. Antifungal activity of all the target compounds were tested using the growth rate method against five plant pathogenic fungi： Fusarium graminearum， Fusarium oxysporum， Verticillium dahliae， Thanatephorus cucumeris and Sclerotinia sclerotiorum. Preliminary biological activity results revealed that some target compounds exhibited a certain inhibitory on the tested fungi at a concentration of 100 μg/mL. Among them， the inhibition rates of 5d against Verticillium dahliae and Thanatephorus cucumeris were 51.5% and 65.8%， respectively， which providing some supports for further structural optimization.

Key words：

pyrazole carboxamide; synthesis; anti-fungal activity