人脑胶质瘤lncRNA PIK3CD-AS2表达及临床意义

郑江林 王 旋 汪珉杰 姜晓兵

胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，具有难治疗、易复发、生存期短的特点[1～3]，特别是胶质母细胞瘤，中位生存期仅8 个月左右[4]。近年来，胶质瘤潜在的分子生物学标志物成为研究的重点。长链非编码RNA（long-coding RNA，lncRNA）是一类长度大于200 个核苷酸的非蛋白编码转录子，通过染色质修饰、转录修饰和转录后修饰等参与基因的表达调控，与肿瘤细胞的增殖、侵袭、代谢、耐药等紧密相关[5，6]。本文探讨lncRNA PIK3CD-AS2在人脑胶质瘤中的表达情况及临床意义。

1 资料与方法

1.1 公共数据库检索 检索TCGA 数据库（https://portal.gdc.cancer.gov/）下载胶质瘤组织RNA测序数据及对应的临床数据。纳入标准为：①总生存期≥30 d；②WHO 分级明确；③IDH 突变、1p19q共缺失和MGMT 启动子甲基化数据完整。最终纳入符合标准的胶质瘤共531 例。检索GTEx 数据库（https://gtexportal.org/）下载1 152例正常脑组织的RNA测序数据作为对照。所有RNA 测序数据经过统一的标准化处理。

1.2 临床病例 收集2010 年9 月至2015 年6 月手术切除的原发性胶质瘤标本127例，其中男84例，女43例；年龄19～76 岁，平均（45.14±11.50）岁；WHO 分级Ⅱ级45例，Ⅲ级55例，Ⅳ级27例。所有病人均为首次手术且术前未行放化疗，术后均随访至2020 年6月或直至死亡。另收集2018 年1 月至2019 年10 月颅脑损伤内减压术中切除的正常脑组织标本38 例作为对照，其中男22 例，女16 例；年龄24～69 岁，平均（44.24±11.53）岁。本研究由华中科技大学同济医学院研究伦理委员会批准。

1.3 临床病例的lncRNA PIK3CD-AS2 的提取及检测 采用Trizol 提取总RNA，测定RNA 纯度和浓度，应用逆转录试剂盒（Takara RR036A）逆转录成cDNA，qRT-PCR 采用TB Green Premix Ex TaqⅡ（Takara RR820A），检测lncRNA PIK3CD-AS2 表达水平。引物序列：PIK3CD-AS2 正义链5'-GGGATCATAAATGCTTGCTGTT-3'，反义链5'-CGTATTAGTTACTGGTTGCTGTT-3'；内参GAPDH 正义链5'-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3'，反义链 5'-TGGGTGGAATCATATTGGAACA-3'。采用2-△△Ct法进行相对定量分析，每个组织样品实验重复3次。

1.4 统计学分析 应用SPSS 25.0软件分析；定量资料以表示，采用t检验；定性资料采用χ2检验和Fisher 确切概率法检验；Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，采用Log-rank 检验；多因素Cox 风险回归模型分析预后影响因素；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 公共数据库分析结果 与正常脑组织（GTEx；n=1 152）相比，胶质瘤组织（TCGA；n=531）lncRNA PIK3CD-AS2 表达水平显著升高（P＜0.001；图1）。胶质瘤WHO 分级越高，PIK3CD-AS2 表达水平明显增高（P＜0.001；图1）。

图1 检索TCGA和GTEx数据库分析胶质瘤组织与正常脑组织lncRNA PIK3CD-AS2的表达情况

以PIK3CD-AS2表达水平中位数为界，将TCGA中531 例胶质瘤分为高表达组（265 例）和低表达组（266例）。多因素Cox风险回归模型分析显示，年龄增大、WHO 高级别以及PIK3CD-AS2 高表达是胶质瘤预后不良的独立危险因素（P＜0.001，图3），而IDH突变和1p19q共缺失是胶质瘤预后较好的独立保护因素（P＜0.05，图2）。生存曲线分析显示，高表达组总生存期较低表达组显著缩短（P＜0.001；图3）。

图2 检索TCGA数据库应用多因素Cox比例回归风险模型分析胶质瘤预后影响因素

图3 检索TCGA 数据库应用生存曲线分析PIK3CD-AS2 表达水平与胶质瘤病人总生存期的关系

2.2 临床病例分析结果 与正常脑组织相比，胶质瘤组织lncRNA PIK3CD-AS2 表达水平显著升高（P＜0.0001）。随胶质瘤WHO分级升高，PIK3CD-AS2表达水平也明显增加（图4）。以PIK3CD-AS2 表达水平中位数为界，将127例胶质瘤分为高表达组（63例和）低表达组（64 例）。多因素Cox 风险回归模型分析显示例，WHO 高级别以及PIK3CD-AS2 高表达是胶质瘤预后不良的独立危险因素（P＜0.001；表1）。生存曲线分析显示，高表达组总生存期较低表达组显著缩短（P＜0.001；图5）。

表1 临床收集的127例胶质瘤生存预后影响因素的Cox比例回归风险模型分析

图4 临床检测125例胶质瘤lncRNA PIK3CD-AS2表达水平

图5 生存曲线分析临床收集的127 例脑胶质瘤lncRNA PIK3CD-AS2表达水平与病人总生存期的关系

3 讨论

胶质瘤为中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，难以完全切除，术后易复发，预后极差，因此，寻找胶质瘤潜在的分子生物学标志物具有重要意义。Wu 等[7]发现lncRNA DUXAP10 通过HuR/Sox12 信号轴维持胶质瘤细胞的干细胞特性。Cai 等[8]发现lncRNA LINC0098能够通过CBX3介导的c-Met/Akt/mTOR 信号轴抑制胶质瘤细胞增殖。这表明，lncRNA参与胶质瘤的发生与发展过程。

lncRNA PIK3CD-AS2位于染色体1p36.22，大小为953 bp。Zheng 等[9]研究发现PIK3CD-AS2 在肺腺癌中高表达，并且通过PIK3CD-AS2/YBX1/p53信号轴促进肺腺癌细胞增殖。本文首先检索公共数据库进行生信分析，结果发现与正常脑组织比，胶质瘤组织lncRNA PIK3CD-AS2显著高表达，并且随胶质瘤WHO分级的升高，PIK3CD-AS2的表达也明显增加。这提示PIK3CD-AS2与胶质瘤的发生和恶性进展存在一定的关系。同时，本文还发现PIK3CD-AS2 高表达病人总生存期显著低于低表达病人。为验证数据库检索结果的可靠性，我们收集127 例临床胶质瘤病例进行分析，结果与公共数据库检索结果相符，进一步证实了PIK3CD-AS2作为胶质瘤分子生物学标志物的价值。

总之，lncRNA PIK3CD-AS2 在胶质瘤中高表达，可作为胶质瘤病人预后生物学标志物。