蚯蚓粪颗粒对猕猴桃溃疡病生化机制的影响

姜礼黔，李 渺，何 鹏，龚子雄，雷钱杨，万林松，柏 松，吕梦岚，卢永仲，魏 娴

(1.贵州沃家永续农业发展有限责任公司，贵州 贵阳 550200；2.贵州理工学院化学工程学院，贵州 贵阳 550003)

0 引言

植物细菌性病害是造成我国农业经济损失的主要原因之一，猕猴桃溃疡病是典型的细菌性病害，是由丁香假单细胞杆菌猕猴桃致病变种引起的一种毁灭性猕猴桃病害，它具有传播快速、侵染范围广、耐低温、腐生性强、传播隐蔽的特点，给我国猕猴桃产业带来巨大损失，猕猴桃溃疡病传播有隐蔽性，在猕猴桃溃疡病侵染植株的早期，植株外部无明显变化，因此很难发现植株已被感染，等到植株有菌脓流出时，危害已经扩展蔓延，严重时造成死树毁园，给猕猴桃产业带来毁灭性毁坏，因此，研究猕猴桃抗细菌溃疡病的新型防治方法具有重要意义[1-6]。

化学农药的出现，虽然有效抑制了植物细菌性病害，提高了农作物的产量，但对环境也带来一些负面影响，化学农药的大量使用，不仅对环境造成污染，也使细菌的抗药性增加，随着人们环保意识的增强，寻找对环境友好的新型防治剂，已经成为当前植物保护研究人员的研究热点。蚯蚓粪作为新型的防治剂，源于天然，与环境相容性好，对人畜无害，符合贵州果园“清园”行动要求，因此，研究蚯蚓粪颗粒剂对猕猴桃溃疡病的防治效果具有重要的现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料

试供植物样品：猕猴桃植株采自贵州省贵阳市修文县大石乡猕猴桃种植基地。

试供培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。

试供菌种：猕猴桃溃疡病菌，由贵州理工学院化学与工程学院实验室提供。

试供蚯蚓粪颗粒：采自修文太平二号蚯蚓养殖厂，经冷冻干燥制得蚯蚓粪颗粒剂，由贵州理工学院化学工程学院实验室提供。

1.2 方法测定

1.2.1 待测物的抑菌活性测试方法

采用菌丝生长速率法测定蚯蚓粪颗粒的抗猕猴桃溃疡病菌的抑菌活性，在无菌条件下，将灭菌的PDA培养基冷却至50 ℃左右，将配制好的不同浓度的蚯蚓粪药液(约20 mL)倒入培养皿中，在培养好的试供菌的菌落的周围，用6 mm的打孔器打取长势一致的菌饼接入培养皿的中间位置，重复3次上述操作，在28 ℃的条件下倒置培养，以PDA作为空白对照，叶枯唑作为商品化的对照药剂，待对照长满培养皿后，用十字交叉法测试菌落直径，参照下列公式计算蚯蚓粪颗粒剂对猕猴桃溃疡病菌的抑制率：

菌落直径=测试直径长度-菌饼直径长度

蚯蚓粪颗粒剂对猕猴桃溃疡病菌的抑制率=[(对照菌落的直径长度-处理菌落的直径长度)/对照菌落的直径长度]×100%

1.2.2 数据处理

用Excel和DPS软件进行数据分析与统计，将菌丝生长抑制率转换成抑菌几率值y，药液浓度转化成对数值x，采用回归方程求得不同浓度待测物对试供菌株的毒力回归方程为

y=ax+b

(1)

a为回归方程的斜率，如果a为正，代表浓度跟抑制率成正相关关系，如果a为负，代表浓度跟抑制率成负相关关系，在毒力学上用于表示剂量死亡曲线的坡度；b为回归直线与y轴的交点。并得到相关系数R和半最大效应浓度EC50值。

1.2.3 猕猴桃植株的生化指标检测方法

参照相关植物生理学检测技术文献[7-10]。

2 结果分析

2.1 蚯蚓粪对猕猴桃溃疡病的抑制活性

蚯蚓粪对猕猴桃溃疡病的抑制活性情况如表1所示。

表1 蚯蚓粪对猕猴桃溃疡病的抑制活性

表1结果表明，蚯蚓粪对猕猴桃溃疡病菌具有一定的抑制作用，EC50值为52.4 mg/mL。略优于对照药剂叶枯唑，EC50值为49.5 mg/mL。

2.2 生化指标检测

2.2.1 过氧化酶(POD)

POD是一系列抗氧化活性的酶，POD的作用主要是清除过氧化氢和氧气。猕猴桃植株中的POD变化情况如图1所示。

由图1可知，检测经蚯蚓粪颗粒处理后的被溃疡病侵染的猕猴桃植株中的过氧化酶(POD)的结果显示：在测试第1天时，蚯蚓粪颗粒处理后的感病植株中的POD酶的活性低于未被处理过的感病植株；第5天开始，蚯蚓粪颗粒处理后的感病植株中的POD明显升高。

2.2.2 苯丙氨酸解氨酶(PAL)

苯丙氨酸解氨酶(PAL)是植物次生代谢过程中的关键酶和限速酶，是植物抗病反应过程中的苯丙烷类代谢途径的关键酶，在植物病原物相互作用的过程中，随着苯丙氨酸解氨酶活性的增大，会促进木质素的积累，酚类物质和植保素的合成，因此苯丙氨酸解氨酶被认为是一种植物防御酶。由图2可以发现：检测经蚯蚓粪颗粒处理后的被溃疡病侵染的猕猴桃植株中的苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性从第3天开始持续上升，在第5天时趋于稳定，达到活性的最高值；蚯蚓粪颗粒处理后的PAL酶活性明显高于未处理的感病植株中的苯丙氨酸解氨酶。

2.2.3 超氧化物歧化酶(SOD)

猕猴桃植株中SOD的变化情况如图3所示。

由图3可知，在1～3 d时，待测植株中的SOD酶活性都上升，但在3 d后，感病植株中的SOD酶活性逐渐下降，蚯蚓粪颗粒处理后的被溃疡病侵染的猕猴桃植株中的SOD酶的活性逐渐上升，第5天后显著高于其他处理，SOD也是一种抗氧化活性酶，它的重要作用是清除O-2，该试验中SOD活性逐渐提高，并且变化幅度可能与蚯蚓粪诱导过程中产生的氧自由及含量的变化有关。

2.2.4 叶绿素

猕猴桃植株中叶绿素的变化情况如图4所示。

由图4可知，经过蚯蚓粪颗粒处理后的感病植株中叶绿素的含量明显增加，从第3天开始上升，并达到叶绿素含量的最高值，一直持续到第9天，蚯蚓粪颗粒处理后的被溃疡病侵染的猕猴桃植株中的叶绿素含量的上升趋势明显高于对照中的叶绿素含量上升趋势，叶绿素含量的增加使植株的光合作用增强，从而减轻了植株的病状。

3 结语

活性测试结果表明，蚯蚓粪颗粒对猕猴桃溃疡病具有一定的抑制作用，EC50值为52.4 mg/mL，略优于对照药剂叶枯唑(EC50值为49.5 mg/mL)。生理生化的研究结果也表明，当感病植株经蚯蚓粪颗粒处理过后，植株内的有关抗性酶，苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)的活性增强，植株内叶绿素的含量增加，植物体内相关抗性酶的活性增加可能加强了植物自身的抗病能力，此结果与活性测试结果一致。综上所述，蚯蚓粪颗粒能有效防治猕猴桃溃疡病，有希望成为对猕猴桃溃疡病的新型防治剂。