合成四氢姜黄素结构表征及体外抗氧化性

杜淑霞 单 旺 徐 丽 滕晓焕 谭奇坤

(1. 广东轻工职业技术学院轻化工技术学院，广东 广州 510300；2. 南海油脂工业〔赤湾〕有限公司，广东 深圳 518000；3. 暨南大学食品科学与工程系，广东 广州 510632)

四氢姜黄素是姜科植物姜黄根茎中分离出的姜黄素的氢化衍生物，无色无臭，因其良好的抗氧化、抗肿瘤和抗动脉粥样硬化的作用和安全性，在食品工业中被用作食品添加剂，在制药工业中可作为新型的医药原料和中间体。

目前国内外主要应用姜黄素通过化学法或微生物法制备四氢姜黄素[1-2]，但姜黄素需从植物中提取，成本较高，而以大宗化工中间体香兰素作为起始原料成本相对较低，但未见相关报道。在活性研究方面，目前在综合评价四氢姜黄素体外抗氧化能力、探讨其在油脂中的抗氧化能力等方面也未见相关报道。

试验拟以香兰素、乙酰丙酮为起始原料，经克莱森缩合反应、氢化反应合成四氢姜黄素，采用紫外—可见分光光度(UV-VIS)、红外光谱(IR)、核磁共振波谱(1H-NMR，13C-NMR)等方法对四氢姜黄素的纯度和结构进行鉴定，从清除DPPH自由基能力、清除ABTS自由基能力、总抗氧化能力、铁离子还原能力、金属离子鳌合能力方面，对四氢姜黄素的抗氧化能力进行测试，并采用GB/T 21121—2007动植物油脂加速氧化测试法测定了其在花生油、芝麻油、猪油等油脂中的抗氧化能力，并与常见抗氧化剂二丁基羟基甲苯(BHT)和维生素C(VC)进行对比。旨在探索四氢姜黄素的更有效的制备方法，为其更好的开发和应用提供理论基础和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

香兰素、乙酰丙酮、三氧化二硼、硼酸三丁酯、三乙胺、DPPH、ABTS 、三吡啶三嗪(TPTZ)、氘代氯仿、过硫酸钾、磷酸钠、四水合钼酸铵、氯化铁、氯化亚铁、菲啰嗪：分析纯，上海源叶生物科技有限公司；

钯碳：分析纯，广州苏喏化工有限公司；

磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、无水硫酸钠、石油醚、正己烷、乙酸乙酯、丙酮、盐酸、硫酸、冰乙酸：分析纯，天津市富宇精细化工有限公司；

四氢姜黄素(纯度≥98%)、二丁基羟基甲苯(BHT，纯度≥99%)、维生素C(VC，纯度≥99%)：分析标准品，美国Aladdin公司；

花生油、芝麻油、猪油：市售。

1.1.2 主要仪器设备

电子天平：EL104型，瑞士Mettler Toledo公司；

数显智能控温磁力搅拌器：SZCL-2型，巩义市予华仪器有限责任公司；

紫外—可见分光光度计：UV-1601型，北京北分瑞利分析仪器公司；

pH计：PHS-3E型，仪电科学仪器公司；

旋转蒸发器：RE-52型，上海嘉鹏科技有限公司；

氧化稳定测定仪：734型，瑞士Metrohm公司；

红外光谱仪：EQUNIOX-55型，德国Bruker公司；

核磁共振波谱仪：AVANCEIII型，瑞士布鲁克公司。

1.2 试验方法

1.2.1 四氢姜黄素的合成 在100 mL圆底三口烧瓶中依次加入2.0 g乙酰丙酮、1.0 g三氧化二硼、20 mL乙酸乙酯，连接回流冷凝装置，电热套加热至50 ℃，在磁力搅拌下反应4 h。反应完成后加入6.1 g香兰素，9.2 g硼酸三丁酯，搅拌30 min。再将2 mL三乙胺溶于10 mL乙酸乙酯，在30 min内缓慢滴加至圆底三口烧瓶中，滴加完成后，反应温度控制在50 ℃，反应4 h。加入30 mL盐酸(0.4 mol/L)，升温至60 ℃，搅拌反应2 h。将反应液转移到分液漏斗，静置30 min，充分分层后，收集乙酸乙酯层，水层用30 mL乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，经无水硫酸钠干燥，抽滤得滤液，减压蒸馏除去乙酸乙酯，将得到的黄色固体进行硅胶柱层析分离，洗脱体系为石油醚/乙酸乙酯，洗脱液比例(V石油醚∶V乙酸乙酯)为4∶1，3∶1，2∶1，1∶1，进行梯度洗脱，收集相同组分，减压蒸馏得到姜黄素，橙黄色结晶粉末，重2.5 g，产率67.90%。

称取10.0 g反应产物姜黄素，加入高压反应釜中，再依次加入2.5 g钯碳(Pd-C，4%)，300 mL丙酮，先通入氮气置换出反应釜中的空气(重复3次)，再通入氢气置换出氮气(重复3次)，在机械搅拌(300 r/min)，压力0.1 MPa，温度25 ℃下反应6 h。反应完成后抽滤除去钯碳，减压蒸馏除去溶剂丙酮，将得到的淡黄色固体进行硅胶柱层析分离，洗脱体系为正己烷/乙酸乙酯，洗脱液比例(V正己烷∶V乙酸乙酯)为5∶1，4∶1，3∶1，2∶1，1∶1，进行梯度洗脱，收集相同组分，减压蒸馏得到白色结晶粉末，即为四氢姜黄素，重6.8 g，熔点91～92 ℃(文献[3]值：92～93 ℃)，产率67.30%。根据上述两步反应的产率得到四氢姜黄素合成总产率为45.70%。合成路线见图1。

图1 四氢姜黄素的合成路线图Figure 1 Synthetic route of tetrahydrocurcumin

1.2.2 纯度分析 采用紫外—可见分光光度法。将四氢姜黄素标准品的乙醇溶液(质量浓度约为10 mg/L)用紫外—可见分光光度计进行全波长扫描，得到四氢姜黄素的最大吸收波长。在最大吸收波长处测定不同质量浓度的四氢姜黄素标准品乙醇溶液吸光度，以吸光度和质量浓度绘制标准曲线，得到回归方程和相关系数。在最大吸收波长处测定已知质量浓度的产物的吸光度，根据产物吸光度和线性回归方程计算出产物中四氢姜黄素含量。

1.2.3 四氢姜黄素的体外抗氧化性测定

(1) DPPH自由基清除能力：配制质量浓度的四氢姜黄素、BHT、VC溶液作为待测样液。参考文献[4]的方法，将0.3 mL各待测液和3 mL DPPH (0.1 mmol/L)充分混匀，室温条件下避光静置30 min后，在517 nm处测定吸光度。同时以乙醇代替试样溶液做空白试验。根据式(1)计算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

X1——自由基清除率，%；

A1——试样液吸光度；

A0——空白试液吸光度。

(2) ABTS自由基清除能力：配制不同质量浓度的四氢姜黄素、BHT、VC溶液作为待测样液。参考文献[5]的方法配制ABTS工作液，将0.3 mL各待测样液与3 mL ABTS工作液充分混匀，室温条件下避光静置10 min后，在734 nm处测定吸光度。同时以乙醇代替试样溶液做空白试验。根据式(1)计算ABTS自由基清除率。

(3) 总抗氧化能力：配制不同质量浓度的四氢姜黄素、BHT、VC溶液作为待测样液。参考文献[6]的方法，将0.3 mL各待测样液与3.0 mL试剂溶液(0.6 mol/L的硫酸、28 mmol/L的磷酸钠、4 mmol/L的钼酸铵各1 mL)充分混匀，置于95 ℃恒温水浴90 min，冷却后，在695 nm处测定吸光度。同时以乙醇代替试样溶液做空白试验。

(4) 铁离子还原能力：配制不同质量浓度的四氢姜黄素、BHT、VC溶液作为待测样液。参考文献[7]的方法配制FRAP试液，取3 mL预热的FRAP试液，加入0.3 mL的待测样液，充分混合后于37 ℃水浴条件下避光反应30 min。于593 nm处测定吸光度。同时以乙醇代替待测样液做空白试验。

(5) 金属离子鳌合能力：配制不同质量浓度的四氢姜黄素、BHT、VC溶液作为待测样液。参考文献[8]的方法，取2.4 mL各待测样液于10 mL具塞试管中，加入30 μL FeCl2溶液(2 mmol/L)和60 μL菲啰嗪溶液(5 mmol/L)，充分混匀后在室温放置10 min，在562 nm处测定吸光度。同时以乙醇代替试样溶液做空白试验。根据式(2)计算亚铁离子螯合率。

(2)

式中：

X2——亚铁离子螯合率，%；

A2——试样液在562 nm处吸光度；

A3——空白试液在562 nm处吸光度。

1.2.4 四氢姜黄素在油脂中的抗氧化性测定 参照GB/T 21121—2007《动植物油脂 氧化稳定性的测定(加速氧化测试)》，采用氧化稳定测定仪测定四氢姜黄素在花生油、芝麻油、猪油中的抗氧化能力，并与BHT进行对比。试验测定条件：油脂添加量为3.0 g，四氢姜黄素、BHT添加量为0.2 g/kg，空气流速为10 L/h，加热温度为120 ℃。平行测定3次，取氧化诱导时间平均值。

1.2.5 数据处理 使用Excel和Origin 9.0软件进行数据分析，试验结果为3次平行测定的平均值。

2 结果与分析

2.1 产物纯度

用紫外—可见分光光度计全波长扫描结果显示，四氢姜黄素在239 nm处有最大吸收。配制质量浓度为2，4，6，8，10 mg/L的四氢姜黄素标准品乙醇溶液，在239 nm 处测定其吸光度，以吸光度为纵坐标、质量浓度为横坐标绘制的标准曲线，如图2所示，回归方程和相关系数为：y=0.045 3x+0.009 5，R2=0.998 0。同时测得质量浓度为6 mg/L的产物在239 nm处的吸光度为0.275，经计算产物中四氢姜黄素含量为97.68%，即产物纯度为97.68%。

图2 四氢姜黄素标准曲线

2.2 产物红外光谱表征

图3 产物的红外光谱图Figure 3 IR spectrogram of product

2.3 产物核磁共振波谱分析

2.3.1 产物核磁氢谱 产物的核磁共振氢谱如图4所示，

图4 产物的1H-NMR谱图Figure 4 1H-NMR spectrum of product

1H-NMR (500 MHz，CDCl3)分析如下：δ6.66～6.83(m，6H，H-2’ 5’ 6’ 2” 5” 6”)，δ5.42～5.51(m，2H，H-4)，δ3.86(s，6H，—OCH3)，δ2.53～2.86(m，8H，H-1 2 6 7)，其中化学位移为7.26的峰为溶剂峰CDCl3，与文献[10]报道相同。

2.3.2 产物核磁碳谱 产物的核磁共振碳谱如图5所示，13C-NMR(500 MHz，CDCLl3) 分析如下：δ198.18(C3，C5)，δ146.38(C3’，C3”)，δ143.95(C4’，C4”)，δ132.53(C1’，C1”)，δ120.78(C6’，C6”)，δ114.30(C2’，C2”)，δ110.89(C5’，C5”)，δ99.79(C4)，δ55.84(C3’—OCH3，C3” —OCH3)，δ40.36(C1，C7)，δ31.28(C2，C6)，其中化学位移为77的峰为CDCL3的溶剂峰，与文献[10]报道相同。

图5 产物的13C-NMR谱图Figure 5 13C-NMR spectrum of product

产物的IR、1H-NMR及13C-NMR数据与目标化合物四氢姜黄素一致，确定合成产物为四氢姜黄素。

2.4 四氢姜黄素的体外抗氧化性试验

2.4.1 清除DPPH自由基能力 由图6可以观察到，VC在试验质量浓度范围内有良好的线性关系，四氢姜黄素在0～60 mg/L的试验质量浓度范围内拥有良好的线性关系，而对于BHT，浓度较高时，BHT的质量浓度与自由基清除率线性较差，这时可以通过缩小抗氧化剂的浓度范围，获得线性关系良好的拟合曲线，并计算其清除50% ABTS自由基时四氢姜黄素质量浓度值(IC50值)。计算得出四氢姜黄素、BHT和VC对DPPH自由基的IC50值分别为(74.33±0.003)，(169.76±0.003)，(52.47±0.004) mg/L。IC50值越低，表明清除DPPH自由基能力越强，反之则越弱。由此可知，在试验质量浓度范围内，四氢姜黄素对DPPH自由基的清除能力稍低于VC，但明显高于BHT。

图6 四氢姜黄素、BHT、VC对DPPH自由基的清除能力

2.4.2 清除ABTS自由基能力 如图7所示，3种抗氧化剂在试验质量浓度范围内具有较好的线性关系。计算得出，四氢姜黄素、BHT和VC对ABTS自由基的IC50值分别为(17.15±0.004)，(17.51±0.004)，(34.53±0.004) mg/L。由此可知，四氢姜黄素对ABTS自由基的清除能力与BHT接近，但明显高于VC。

图7 四氢姜黄素、BHT和VC对ABTS自由基的清除能力

2.4.3 总抗氧化能力 如图8所示，随着质量浓度的增大，各抗氧化剂的总抗氧化能力均呈增加趋势，且四氢姜黄素的总抗氧化能力明显高于BHT和VC。

图8 四氢姜黄素、BHT和VC的总抗氧化能力

2.4.4 铁离子还原能力 在低pH的溶液中，Fe3+和TPTZ会形成Fe3+-TPTZ(Fe3+-三吡啶三嗪)配合物，在有抗氧化剂存在时，配合物被还原成Fe2+-TPTZ，使溶液呈深蓝色，在593 nm处有最大光吸收，且吸光度越大，表明对铁离子还原能力越强。由图9可知，四氢姜黄素的铁离子还原能力显著高于BHT和VC，与文献[11]报道结果一致。

图9 四氢姜黄素、BHT和VC的铁离子还原能力

2.4.5 金属离子鳌合能力 如图10所示，从鳌合趋势上看，随着四氢姜黄素质量浓度的增大，其亚铁离子螯合能力呈上升趋势。而随着BHT和VC质量浓度的增大，其对亚铁离子螯合能力反而减弱；从鳌合效果上来看，在质量浓度为1 000 mg/L时，四氢姜黄素对亚铁离子螯合能力虽然显著高于BHT和VC，但螯合率低于25%，可见四氢姜黄素对亚铁离子的螯合能力较弱。

图10 四氢姜黄素的亚铁离子鳌合能力Figure 10 Ferrous ions chelating activity oftetrahydrocurcumin

2.4.6 四氢姜黄素在油脂中的抗氧化性 由于VC是水溶性抗氧化剂，在油脂中的溶解性较差，因此只选择脂溶性的BHT与四氢姜黄素进行对比。由表1可知，添加了四氢姜黄素的3种油脂，其氧化诱导时间皆长于未添加抗氧化剂的空白组，表明四氢姜黄素在这3种油脂中皆具有抗氧化作用，且在猪油中的抗氧化效果更明显。

表1 油脂的氧化诱导时间†

3 结论

以香兰素为起始原料，经克莱森缩合反应、钯催化氢化反应制备四氢姜黄素，经紫外—可见分光光度、红外光谱、核磁共振波谱对其结构进行确证。试验结果表明，合成路线可行且路线短，合成总产率达45.70%，产物纯度为97.68%，与现有制备方法相比，试验方法原料成本低，具有潜在的价格优势。后续将进一步优化反应条件，扩大合成规模，以期实现产业化。

四氢姜黄素清除DPPH自由基的能力明显高于二丁基羟基甲苯；清除ABTS自由基的能力接近于二丁基羟基甲苯且明显高于维生素C，主要是由于其结构中酚羟基的存在。此外，四氢姜黄素的总抗氧化能力和铁离子还原能力均明显高于二丁基羟基甲苯和维生素C，但对亚铁离子的鳌合能力较弱，由此可知，四氢姜黄素的抗氧化能力主要体现在清除自由基和化学还原方面，与亚铁离子螯合能力的相关性不大。四氢姜黄素在花生油、芝麻油、猪油等油脂中具有一定的抗氧化能力，并且对猪油的抗氧化效果最明显，作为一种以天然产物为导向的抗氧化剂，安全性较好，有良好的应用前景。