基于NF-κB通路研究清眩降压汤对自发性高血压大鼠的肾脏保护作用

陈达鑫，蔡巧燕，张 铃，沈阿灵，褚剑锋，朱正川，龙霖梓，熊晓满，刘 菲，彭 军，林 炜，林 珊*

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州350122；2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建 福州350122；3.福建中医药大学陈可冀学术思想传承工作室，福建 福州350122；4.北京大学医学部中医药临床医学院（西苑），北京100000；5.中国中医科学院西苑医院，北京100091）

原发性高血压病（essential hypertension，EH）简称高血压，是目前世界上最常见的心血管疾病之一［1-2］。慢性高血压引发的心脏、肾脏、大脑等器官损害是高血压致死的主要病因，高血压肾病是原发性高血压的重要并发症，也是引起终末期肾病的常见病因之一［3-4］。统计资料表明，高血压肾脏并发症发病率为42%，其中有18%的患者最终会出现肾功能衰竭。肾脏损害在维持高血压，损害其他靶器官中具有重要的诱发作用，是高血压过程中最重要的病理改变［5-6］。高血压的发展伴随全身慢性炎症，其中各类炎症因子的增加会诱导炎症通路如NF-κB的激活［7］。清眩降压汤是陈可冀院士从临床实践中总结形成的治疗原发性高血压的经验方，研究表明清眩降压汤能明显改善高血压病患者的临床症状和生存质量［8-9］。前期实验研究也证实，清眩降压汤在调控自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）收缩压升高的同时也可以起到肾脏保护作用［8］。本研究在此基础上，通过体内外实验进一步研究清眩降压汤对肾脏的保护作用及其可能作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物与细胞4周龄清洁级SHR大鼠20只，Wistar大鼠10只，体质量190～200 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，实验动物许可证号：SCXK（沪）2017-0008。委托福建中医药大学实验动物中心代购并饲养，许可证号：SYXK（闽）2014-0006。人肾小管内皮细胞NRK52E购自于中国科学院上海生命科学研究院。

1.2 实验药物 清眩降压汤药物组成：苦丁茶30 g，天麻30 g，钩藤30 g，黄芩10 g，川牛膝10 g，生杜仲10 g，夜交藤30 g，生地黄30 g，桑叶15 g，菊花15 g，均购自福建中医药大学附属第三人民医院。按照临床给药量换算为生药量，采用水蒸气回流法蒸煮，所得药液减压过滤后于蒸发皿内蒸干，真空干燥至粉末封装于4℃备用，并用生理盐水配制成灌胃药液。

1.3 实验试剂ELISA试剂盒（江苏酶免实业有限公司）；BCA试剂盒（美国赛默飞世尔科技公司）；Anti NF-κB p65、Anti phospho-NF-κB p65（美国CST公司）；GAPDH一抗、HRP二抗（武汉三鹰生物技术有限公司）；AngⅡ（美国Sigma公司），DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶（美国Gibco公司）；PBS缓冲液、青霉素和链霉素（美国Hyclone公司）。

1.4 实验仪器CO2培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Infinite200 PRO多功能酶标仪（瑞士Tecan公司）；垂直电泳槽、ChemiDocXRS＋化学发光成像系统（美国BioRad公司）。

2 实验方法

2.1 动物分组与干预 将20只4周龄SHR大鼠随机分为SHR组和QXJYD组，每组10只，10只Wistar大鼠组成Wistar Kyoto（WKY）组作为正常对照。QXJYD组按5 g／（kg·d）予清眩降压汤药液灌胃，SHR组和WKY组给予等容积生理盐水灌胃，每日给药1次，持续给药8周。

2.2 动物取材 干预8周后，腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉动物，腹主动脉取血后立即取左侧肾脏，并立即置于液氮中；血液样本于4℃下3 000 r／min离心5 min，收集血清；血清和肾脏均放置于-80℃冰箱保存。

2.3 ELISA法检测血清中炎症因子 根据试剂盒说明书步骤操作，于470 nm处分别检测白介素－6（IL-6）、白 介 素-1β（IL-1β）及 肿 瘤 坏 死 因 子-α（TNF-α）的OD值，并计算其表达。

2.4 细胞培养及干预NRK52E细胞用含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM培养基于37℃、5%CO2条件下培养；当细胞汇合至70%～80%时，更换无血清培养基进行同步培养，将细胞按照设计进行分组：Control组（空白组）、QXJYD 50 μg／mL组、QXJYD 100 μg／mL组、AngⅡ组（1×10-7mol／L）、AngⅡ＋QXJYD 50 μg／mL组、AngⅡ＋QXJYD 100 μg／mL组，干预24 h后收集细胞待检测。

2.5 Western bolt检测肾脏组织和NRK52E细胞中p65和p-p65蛋白表达 肾脏组织加入蛋白裂解液，使用组织研磨仪粉碎后，12 000 r／min离心20 min收集上清；NRK52E细胞干预12 h后，用预冷的PBS洗涤3次，收集细胞后加入蛋白裂解液，12 000 r／min离心20 min收集上清。使用BCA法进行蛋白定量，100℃金属浴变性5 min后，使用10%SDS-PAGE进行凝胶电泳；在冰浴下使用PVDF膜进行转膜；转膜结束后，使用5%脱脂奶粉于室温封闭1 h，使用p65（1∶1 000）、p-p65（1∶1 000）的一抗在4℃条 件下孵育过夜，TBST洗3次，5 min／次；用HRP二抗（Rabbit，1∶5 000）室温孵育1 h，TBST洗3次，5 min／次。最后用ECL试剂显影成像。

2.6 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件处理。计量资料符合正态分布以（x±s）表示，采用单因素方差分析，若方差齐，采用LSD法进行各组间两两比较；若方差不齐，则采用Games-Howell法进行两两比较。

3 结 果

3.1 3 组大鼠血清炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α表达比较 见图1。

图1 3组大鼠血清炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α表达比较

3.2 QXJYD对SHR大鼠肾脏组织p65磷酸化的影响Western Blot结果显示：与对照组比较，SHR组大鼠肾脏组织的NF-κB信号通路被激活；与SHR组比较，QXJYD干预可以显著降低p65的磷酸化水平；3组之间总p65无显著改变。见图2。

图2 QXJYD对SHR大鼠肾脏组织p65磷酸化的影响

3.3 QXJYD对AngⅡ诱导NRK52E细胞p65磷酸化的影响 与Control组比较，单独QXJYD 50 μg／mL干预后NRK52E细胞p65磷酸化水平下调，而QXJYD 100 μg／mL无明显差异；AngⅡ可以显著激活NRK52E细胞中p65的磷酸化，QXJYD可下调AngⅡ刺激所引起p65的磷酸化水平升高。见图3。

图3 QXJYD对AngⅡ诱导NRK52E细胞p65磷酸化的影响

4 讨 论

高血压属中医“眩晕”“头痛”等范畴，病机多属本虚标实，与肝、心、肾密切相关，其前期以肝阳上亢证最为多见。中医药治疗高血压在病因病机和治疗方面均积累了丰富的经验，加之中药复方具有多成分、多环节、多靶点的整体作用特点，使其在降低血压，减少并发症方面显现出现代药物所不具备的天然优势［10］。清眩降压汤是陈可冀院士60余载临床治疗高血压的经验处方，针对高血压初期阶段“肝阳上亢”的证候特点，选用苦丁茶、天麻、钩藤、桑叶、菊花、黄芩、夜交藤、杜仲、生地黄、川牛膝等10味药物配伍而成，该方以清热为主，兼以滋补肝肾，共奏平肝阳、清肝热、益肝肾之功，主要适用于肝肾阴虚、肝阳上亢或阴虚上亢证的初发Ⅰ级高血压患者（与当代人群体质特点及患高血压的证候特征相一致），疗效确切。课题组前期研究证实清眩降压汤对SHR大鼠有显著的血压调控作用，同时对心、脑、肾等靶器官的器质性损伤有较好的治疗作用［11-12］。

继发于高血压的肾脏损害即高血压性肾病，是高血压病最重要的并发症之一。高血压病患者体内活性氧（ROS）和脂质过氧化产物（MDA）含量明显增高［13-14］。同时，患者体内超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、硫氧还蛋白过氧化物酶（TPx）和过氧化氢酶（CAT）等活性降低［15-16］。通过在肾脏固有细胞中进行氧化应激反应，激活多种转录因子，如NF-κB，形成肾脏炎症状态［17］。本研究结果表明，SHR组大鼠血清中促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α的含量明显升高，表明高血压的发生发展伴随着全身慢性炎症的发生，而炎症因子浸润肾脏后参与氧化应激损伤，进一步加重肾脏炎症。清眩降压汤可显著降低高血压引起的促炎因子（IL-6、IL-1β及TNF-α）的表达升高。同时体内外实验结果发现，高血压会引起肾脏组织及细胞中p－p65的表达升高，该现象被清眩降压汤干预所抑制，结果提示清眩降压汤防治高血压肾损害与其抑制NFκB信号通路的活化密切相关。

综上所述，本研究证实了清眩降压汤具有良好的肾脏保护作用，其主要途径可能是通过调控NFκB通路，进而减轻肾脏炎症。但其如何具体影响肾脏氧化应激损伤的机制，有待进一步探讨。