毒死蜱对斑马鱼抗氧化体系的影响

李方敏,姚灿灿,丁存宝

华北理工大学 生命科学学院,河北 唐山 063000

毒死蜱，又称氯吡硫磷，是广泛应用于农业生产的杀虫剂之一，具有胃毒、触杀、熏蒸三重作用[1]。在叶片上残留时间较短，但在土壤中残留时间较长[2]，因此对地下害虫防治效果较好，但会对水生环境造成长期不利影响，导致多种水生鱼类死亡[3]。适用于水稻、小麦、棉花、果树、蔬菜、茶树上多种咀嚼式和刺吸式口器害虫，也可用于防治卫生害虫。有研究表明，9.6 mg/L 毒死蜱严重抑制了SOD 的活性，造成CAT 活性下降，且毒死蜱对CAT 的影响随浓度的增高影响越大，也能诱导过氧化物酶（POD）活性上升和丙二醛（MDA）含量升高，致使谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）活性先降低后上升[4]。毒死蜱对脑组织中谷胱甘肽S-转移酶（GST）的影响表现为脑区的选择性和同工酶种类的选择性，主要作用于小脑中GST，而GST 也参与了毒死蜱的生物转化过程[5]。

斑马鱼是一类脊椎模式生物，具有体型微小，与人类基因相似度高，繁殖快，饲养简单等优势，常作为模式生物来进行各种研究，也可用于水质环境的监测[6]。斑马鱼早期胚胎对多数环境毒性物质以及药物具有相当强的敏感性，适合药物的毒性评价及筛选[7]。斑马鱼基因与人类基因相似度高达87%，有关化学物质在斑马鱼体内得到的毒理学研究结果在多数情况下也适用于人体环境，被国际经济合作组织(OECD)在环境化学品毒性测试指导手册中列为测试的推荐实验物种。指示生物的反应对于污染物的现场评估具有很大的潜力，因为他们可以对污染物的影响进行有效地整合和调控，能够更加灵活和现实地反应污染物对现实环境的侵害作用[4]。斑马鱼类是水体中主要生物，用它作为水环境监测的指示生物对水环境发生的物理化学和生物性的各种变化反应灵敏，斑马鱼类的毒性实验是研究水体中有毒物质对鱼类不良影响的重要实验，通过鱼类实验能够在一定程度上反应水体污染情况，可以为保护环境提供有价值的信息[8-11]。

因而，本研究利用斑马鱼研究水体中农药残留的监测，利用不同浓度的毒死蜱处理斑马鱼，之后监测斑马鱼体内过氧化物酶（SOD），过氧化氢酶（CAT），丙二醛（MDA）等活性及水平变化，从而作为农药残留检测的重要指示生物，指导农药残留的快速生物法检测。

1 材料与方法

1.1 试验生物

本实验所用斑马鱼购于唐山市水产市场，均长2～3 cm。实验开始前斑马鱼室内驯养1 周，60 条分别置于四个容量为1 L 的鱼缸内，自然死亡率小于2%，每隔24 h 换水，室温25 ℃左右。

1.2 试验用水

本实验取用经24 h 晾晒的自来水（除去自来水中含有的氯）。水温23 ℃左右。

1.3 试剂和仪器

毒死蜱原药、超氧化物歧化酶测定试剂盒、过氧化氢酶测定试剂盒、丙二醛试剂盒、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒均购于南京建成科技有限公司。

紫外—可见分光光度计（SP-756P 上海光谱仪器有限公司）；高速冷冻离心机；增氧泵（SB-108中山市松宝电器有限公司）；电热恒温水浴锅（HHD-2 上海比朗仪器有限公司）。

1.4 试验方法

采用半静态实验法，随机将斑马鱼放到四个容量为1 L 的鱼缸内，每组15 条，设其中一组为空白对照组，另外三组染毒质量浓度分别为0.01µg/L，0.1µg/L，1µg/L，分别在实验的7 d，14 d，21 d，28 d 对斑马鱼进行实验，检测各项指标并记录。

1.5 酶活性的测定

1.5.1 组织匀浆的制备（1）每个鱼缸内随机选择一条斑马鱼，冷冻麻醉后进行解剖取其肝脏，取斑马鱼的肝脏(0.2 g～1 g)在冰冷的盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，放入5 mL 的小烧杯内。

（2）用移液管量取预冷的匀浆介质，匀浆介质的体积总量是是组织块重量的9 倍，用移液管取总量的2/3 的匀浆介质于烧杯中，用眼科小剪刀尽快剪碎组织块（此步骤应在冰浴中进行）。

（3）将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余1/3 的匀浆介质冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，上下转动研磨数10 次，充分研碎，使组织匀浆化。

（4）将制备好的10%的匀浆用普通离心机3000 r/min 左右离心10～15 min，将离心好的匀浆液留上清弃下面沉淀。取上清液进行各种测定。

1.5.2 离心 将上述EP 管放入高速冷冻离心机中离心，1000～3000 r/min，10 min，取出后静置，待测。

1.5.3 考马斯亮蓝蛋白测定 蛋白标准液或样品中的蛋白分子上的-NH3+与考马斯亮蓝染料上的阴离子结合，使溶液变为蓝色，通过测定吸光度可计算出蛋白含量[12,13]。可在最大吸收波长595 nm 处测定吸光度，计算得到蛋白质含量。取3 支试管分别标为空白管、标准管和测定管并向其中加入3.0 mL的考马斯亮蓝显色液，并在空白管中加入0.05 mL 的双蒸水，标准管中加入0.05 mL 的0.563 g/L 的蛋白标准品，测定管中加入0.05 mL 的样品。混匀，静置10 min，波长595 nm，光径1 cm 处双蒸水调零，测定各管吸光度值。

1.5.4 过氧化氢酶（CAT）活力测定 过氧化氢酶可以分解过氧化氢。H2O2是一种主要的ROS，氧化位于细胞膜上的蛋白质和脂质，并且能穿过细胞膜在细胞内与铁离子反应产生强活性的自由基，从而诱导细胞损伤。钼酸铵可中止CAT 分解H2O2反应，剩余的H2O2与钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物。在405 nm 处测定其变化量，可计算出CAT 的活力。

1.5.5 超氧化物歧化酶（SOD）的测定 超氧化物歧化酶（SOD）对机体的氧化平衡起着重要的作用，此酶能清除超氧阴离子自由基（O2－）保护细胞免受损伤。黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生的O2－，可氧化羟胺形成亚硝酸盐，与显色剂作用呈紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。被测样品中含SOD，会抑制O2－，亚硝酸盐的浓度降低，比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中的SOD 活力。分别取2 支试管为测定管和对照管，并向两支试管中加入1 mL 试剂1 应用液、试剂2、试剂3、试剂4 应用液各100 μL。向测试管中加入样品30 μL，对照管加入双蒸水30 μL，以上两支试管震荡混匀后37 ℃水浴40 min 后，加显色剂200 μL。混匀，室温放置10 min 于波长550 nm 处，1 cm 光境比色杯，双蒸水调零比色。每克组织蛋白中过氧化氢酶（CAT）每秒钟分解吸光度为0.5～0.55 的底物中的过氧化氢相对量为一个过氧化氢酶的活力单位。

1.5.6 丙二醛（MDA）的测定 机体产生氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸（PUFA），引发脂质过氧化作用，并因此形成的脂质过氧化物(MDA)是膜脂过氧化最重要的产物之一，可放大活性氧的作用，从而加剧膜的损伤。因而测试MDA 的量常常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度。丙二醛（MDA）可与硫代巴比妥酸（TBA）缩合，形成红色产物，在532 nm处有最大吸收峰。即TBA 法。取1 cm 光径石英比色皿，紫外240 nm，双蒸水调零备用。取经过处理的样本0.02 mL 加入比色皿底部，将已预温至25 度，OD 值在0.5～0.55 之间的底物溶液3 mL 直接用5 mL 或10 mL 的打移液器快速冲入比色皿中，240 nm 处立即测定吸光度，记下OD1值，比色皿不要取出，1 min 时立即再测一次吸光度，记下OD2值。

2 结果及分析

2.1 考马斯亮蓝测定蛋白质测定

按考马斯亮蓝试剂盒操作步骤进行实验，检测数据如图1，实验初期，随着染毒周期的加长，蛋白质含量随毒死蜱浓度增大而呈上升趋势，第14 d 时蛋白含量达到峰值，随后蛋白质含量逐步下降并趋于稳定。

图1 斑马鱼蛋白含量的测定 Fig.1 Determination of protein content in Zebrafish

2.2 过氧化氢酶(CAT)活力测定

按过氧化氢酶（CAT）试剂盒操作步骤进行实验检测数据后如图2，整体上看同一浓度随染毒周期增长过氧化氢酶的活力先降低后增强，不同浓度梯度时浓度越高到达对应谷值所需时间越短。

图2 斑马鱼过氧化氢酶（CAT）活力的测定Fig.2 Determination of CAT activity in Zebrafish

2.3 超氧化物歧化酶（SOD）活力测定

按超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒操作步骤进行实验检测数据后如图3，整体上看超氧化物歧化酶（SOD）的活力同一浓度随染毒周期增长呈现先减弱后增强的趋势，7 d 时超氧化物歧化酶的活力最强，14 d 后不同浓度梯度间超氧化物歧化酶的活力呈现出先增强后减弱的趋势。

图3 斑马鱼超氧化物歧化酶（SOD）的测定Fig.3 Determination of SOD in Zebrafish

2.4 丙二醛(MDA)含量测定

按丙二醛（MDA）试剂盒操作步骤进行实验检测数据后如图4，7 d 与14 d 之间丙二醛含量急剧下降，14 d 后数值浮动较小。

图4 斑马鱼体内丙二醛（MDA）含量的测定Fig.4 Determination of MDA in Zebrafish

3 结果与讨论

实验数据表明，毒死蜱会对斑马鱼机体内的抗氧化体系有影响。正常情况下，斑马鱼体内CAT，SOD，MDA 三者协调一致，并处在动态平衡状态下，维持自由基在正常水平，毒死蜱破坏了斑马鱼体内的这种平衡，在斑马鱼体内不断积累，进一步影响斑马鱼体内的蛋白质及CAT，SOD，MDA使其抗氧化性体系受到损伤，对斑马鱼有毒害作用[14,15]。

考马斯亮蓝测定蛋白质实验中，随着染毒周期的加长，蛋白质含量随毒死蜱浓度增大而呈上升趋势，达到峰值后蛋白质含量逐步下降并趋于稳定。过氧化氢酶（CAT）活力测定实验中，整体上看同一浓度随染毒周期增长过氧化氢酶的活力先降低后增强，不同浓度梯度时浓度越高到达对应谷值所需时间越短。超氧化物歧化酶（SOD）活力测定实验中，同一浓度随染毒周期增长呈现先减弱后增强的趋势。丙二醛（MDA）含量测定实验中丙二醛含量先急剧下降，而后数值浮动较小。

在农业生产中，毒死蜱作为广泛应用的杀虫剂应注意浓度配比，减小对生态环境的危害。