不同温度对沼液土壤大肠杆菌及理化特性的影响

乔成桓,杨 凌,范雪彤,潘仕梅,杨守军

中国农业大学烟台研究院,山东 烟台 264670

沼液是有机废弃物经厌氧发酵后获得的富含氮磷钾养分、植物生长激素的液体有机肥料，具有提升农田耕地质量、增产提质的作用。在国家大力推进保护环境优先、废弃物资源化利用的形势下，沼液消纳和安全施用不仅是沼气工程可持续运行的核心，更是构建生态循环农业体系、化肥减量的关键。众多研究表明，沼液还田可有效提高土壤养分，提高微生物代谢活性和生物多样性[1-3]。由于沼液中含有大肠杆菌等致病菌，施用后可能造成土壤污染，并通过食物链对人体造成伤害，制约了沼液的还田利用[4]。因此，研究不同温度下土壤中源自沼液的大肠杆菌的变化规律显得尤为重要。

目前有关土壤温度对大肠杆菌数量消涨变化规律的研究存在不同观点。有学者认为土壤温度为5 ℃时，大肠杆菌灭活时间比37 ℃处理更长，但有的研究发现相比于44 ℃，37 ℃更有利于牛粪水中大肠杆菌的生存，低于一定温度时大肠杆菌灭活时间与温度成负相关[5-7]。造成这种现象的原因，可能是因为大肠杆菌属于中温型微生物，当温度不适宜微生物生存时，其新陈代谢、数量和活性将发生变化[8]。除了温度对土壤中大肠杆菌数量产生显著影响外，土壤质地、总碳、总氮、硝酸盐等土壤理化性质也对大肠杆菌具有显著影响，说明土壤中大肠杆菌数量的变化是多种影响因素共同作用的结果[9-12]。目前，有关土壤温度变化以及土壤温度变化所引起的土壤理化性质的相应变化对土壤大肠杆菌数量的协同影响机理研究鲜有报道。为此，本研究探讨了不同温度下土壤中源自沼液的大肠杆菌数量变化的影响机理，以期为沼液农田施用土壤卫生控制提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验起始于2020 年11 月初，于2021 年1 月末结束，试验地点为中国农业大学烟台研究院实验室。试验所用沼液为山东省烟台市牟平区某沼气工程的猪粪沼液，试验所用土壤为棕壤。供试沼液和土壤的主要化学性质如表1 所示。

表1 供试沼液和土壤化学性质Table 1 Characteristics of the experimental biogas slurry and soil

1.2 试验设计

试验采用土柱培养法，所用培养容器为PVC 管，高度为25 cm、内径为7.5 cm。试验分别以培养温度0.6 ℃、16.1 ℃、25 ℃、37 ℃设置4 个处理，每个处理重复3 次。土壤经风干、研磨、过2 mm筛后装入柱子，每柱装土1000 g，随后每柱加入沼液145 g，用无菌水调节土壤持水量为60%，柱子上下端用耐高温封口膜封闭，于不同温度下进行培养。

1.3 样品采样与测定方法

于土壤培养后1 d、2 d、4 d、8 d、15 d、30 d、45 d、60 d，分别采集0～1 cm、4～5 cm、9～10 cm、14～15 cm、19～20 cm 处土壤用于样品分析。土壤中大肠杆菌的测定采用平板计数法[13]；土壤铵态氮和硝态氮含量测定分别采用蒸馏后直接滴定法和紫外分光光度计法[14]；土壤全氮含量测定采用蒸馏后直接滴定法[15]；土壤有机质含量测定采用重铬酸钾外加热法[16]。土壤含氧量测定采用青岛骏源环保设备有限公司提供的便携式四合一有毒有害气体检测仪，仪器型号为20H17041。

1.4 数据的统计分析

数据采用Excel 2016 和SPSS 24.0 进行统计分析，采用最小显著差异法（LSD）处理显著差异性。

2 结果与分析

2.1 不同培养温度对土壤中大肠杆菌数量的影响

沼液施用后不同温度处理的土壤中大肠杆菌数量均呈现先升后降趋势（图1）。由图1-A 可知当培养温度为37 ℃时，0～1 cm 处土壤中大肠杆菌的数量在第192 h 到达峰值，分别比0.6 ℃、16.1℃、25 ℃处理升高了7.34%、25.54%和120.25%；当培养温度为0.6 ℃、16.1 ℃、25 ℃时，0～1 cm 处土壤大肠杆菌数量到达峰值的时间分别比37 ℃处理延后了158 h、148 h 和8 h；当培养温度为25 ℃时，0～1 cm 土壤中菌群数量在第35 d 低于0.6 ℃、16.1 ℃、37 ℃处理，在第60 d 分别是0.6 ℃、16.1 ℃、37 ℃处理的79.76%、90.45%、93.39%。其他深度土壤温度对大肠杆菌数量的影响与0～1 cm 处相似。

图1 不同培养温度对土壤中大肠杆菌数量的影响Fig.1 The influence of different cultivation temperatures on the amount of Escherichia coli in soil

2.2 不同培养温度对土壤有机质含量的影响

由图2 得知，不同温度处理土壤有机质含量均呈下降趋势，有机质含量与深度呈显著负相关（P＜0.05）。由图2-A 所示，在培养温度为37 ℃下培养60 d 时，0～1 cm 处土壤有机质含量分别是0.6 ℃、16.1 ℃、25 ℃处理的86.87%、88.22%和89.41%。当培养温度为37 ℃时，0～1 cm、4～5 cm、9～10 cm、14～15 cm 处土壤铵态氮含量在第60 d 分别比19～20 cm 处土壤减少了3.85%、2.02%、1.83%和0.65%。0.6 ℃、16.1 ℃、25 ℃培养温度对不同深度土壤有机质具有相似影响。

图2 不同培养温度对土壤有机质含量的影响Fig.2 The influence of different cultivation temperatures on soil organic matter content

2.3 不同培养温度对土壤硝态氮含量的影响

如表2 所示，所有温度处理土壤硝态氮含量均成上升趋势。在培养温度0.6 ℃、16.1 ℃、25 ℃、37 ℃下培养60 d 时，0～1 cm、4～5 cm、9～10 cm、14～15 cm、19～20 cm 处土壤中硝态氮含量分别比培养1 d 时上升了15.59%、20.04%、23.84%、19.84%、16.50%、20.21%、25.23%、22.64%、16.41%、23.52%、28.91%、26.57%、23.12%、26.14%、35.73%、35.41%和16.87%、25.91%、30.60%、33.23%。与25 ℃相比，在培养温度为0.6 ℃、16.1 ℃、37 ℃下，0～1 cm 处土壤硝态氮含量分别降低了14.59%、5.34%、5.06%。温度对其他深度土壤硝态氮变化趋势的影响与0～1 cm 处土壤相似，均以14～15 cm处土壤硝态氮含量最高。

表2 不同培养温度对土壤硝态氮含量的影响Table 2 The influence of different cultivation temperatures on the soil nitrate nitrogen content

2.4 不同培养温度对土壤铵态氮含量的影响

由表3 得知，不同温度处理土壤中铵态氮含量均呈下降趋势，铵态氮含量与深度呈显著负相关（P＜0.05）。在培养温度为25 ℃下培养60 d 时，0～1 cm 处土壤铵态氮含量分别是0.6 ℃、16.1 ℃、37 ℃处理的75.86%、98.01%和102.31%。当培养温度为37 ℃时，0～1 cm、4～5 cm、9～10 cm、14～15 cm 处土壤铵态氮含量在第60 d 分别比19～20 cm 处土壤减少了10.70%、8.22%、5.62%和2.46%。0.6 ℃、16.1 ℃、25 ℃培养温度对不同深度土壤铵态氮影响与培养温度为37 ℃相似。

表3 不同培养温度对土壤铵态氮含量的影响Table 3 The influence of different cultivation temperatures on soil ammonium nitrogen content

2.5 不同培养温度对土壤C/N 的影响

土壤C/N 随温度升高呈下降趋势，降低程度与温度成显著正相关（P＜0.05）。与培养温度0.6 ℃处理相比，培养温度为16.1 ℃、25 ℃、37 ℃时，0～1 cm 处土壤C/N 在第60 d 分别降低了1.28%、2.03%、20.79%。与37 ℃相比，0.6 ℃、16.1 ℃、25 ℃处理的0～1 cm 处土壤C/N 数值维持在9.5～10.5范围的时间分别延长了69.23%、53.85%和23.08%。其他深度土壤C/N 变化趋势与0～1 cm 处土壤相似（表4）。

表4 不同培养温度对土壤C/N 的影响Table 4 The influence of different cultivation temperatures on soil C/N

2.6 不同培养温度对土壤含氧量的影响

如图3 所示，不同温度处理土壤的含氧量均呈先升后降的趋势。方差分析表明，第60 d 不同温度处理土壤含氧量无显著性差异（P＞0.05）。土壤中大肠杆菌数量到达峰值时土壤含氧量与温度呈负相关，在培养温度为37 ℃下培养8 d 和15 d 时，9～10 cm 处土壤含氧量分别是0.6 ℃、16.1 ℃和25 ℃处理的99.32%、99.66%、100%和98.98%、99.32%、99.66%，其他深度土壤含氧量对温度的变化趋势与9～10 cm 处土壤相似。

图3 不同培养温度对土壤含氧量的影响Fig.3 The influence of different cultivation temperatures on soil oxygen content

3 讨论

研究结果表明，与37 ℃处理相比，16.1 ℃、25 ℃培养温度抑制大肠杆菌扩繁，这是因为在37.5 ℃大肠杆菌体内酶的活性最高，低于37.5 ℃大肠杆菌代谢受到抑制，温度越低代谢活性越弱[17,18]。但0.6 ℃处理土壤中大肠杆菌数量在第60 d 高于其他温度处理，说明低温下大肠杆菌产生了大量保护酶等蛋白质并降低了细胞膜对有害物质的渗透性，不利于大肠杆菌的灭活[19]。

土壤中大肠杆菌峰值与土壤含氧量呈负相关，说明大肠杆菌在好氧环境下降低速率更快[20]。当培养温度低于37 ℃时，随温度的升高土壤呼吸增强，导致土壤含氧量降低，削弱了溶解氧对大肠杆菌的抑制作用，更有利于大肠杆菌的扩繁[21]。

土壤中氮素存在矿化作用、铵态氮挥发、硝化作用等氮素的转化过程，沼液施用后土壤中铵态氮含量随培养时间延长呈下降趋势，但硝态氮含量呈上升趋势[22]。与其他温度处理相比，培养温度为25 ℃时第60 d 土壤硝态氮含量最高且大肠杆菌数量最低，其中14～15 cm 处土壤对大肠杆菌数量的抑制作用最显著。数据说明，25 ℃条件更有利于硝化作用，导致土壤中硝态氮含量的升高，进而对大肠杆菌的生长产生抑制作用[23,24]。研究发现，铵态氮的降低强度明显高于硝态氮，这可能是因为温度的升高导致了铵态氮的逸散，抑制了硝化作用[25]。所有温度处理14～15 cm 处土壤硝态氮含量最高，对大肠杆菌数量抑制效果强于其他深度土壤，主要是因为14～15 cm 处土壤的氨氮挥发量明显低于上层土壤，利于氨氧化作用，为硝化作用提供更多的氮源[26,27]；14～15 cm 处土壤铵态氮含量无显著性差异且土壤含氧量更高，由于氧含量降低能够促进反硝化作用[28]，因此14～15 cm 处土壤硝态氮含量明显高于19～20 cm。

土壤C/N 为10:1 时最不利于大肠杆菌的生存[29]。沼液施用后所有温度处理土壤C/N 均高于或低于10:1，对大肠杆菌生长产生抑制，造成数量上的降低。研究结果表明，随着培养温度的降低和土层深度的增加，土壤C/N 下降幅度减少，C/N 维持在10 左右的时间越长。这是因为外源有机质使微生物产生了更多胞外酶，当培养温度较高时这些胞外酶分解潜力得到表达，分解有机质使土壤C/N降幅增大[30]。研究表明，0.6 ℃培养温度下大肠杆菌数量最高，这可能是由于降低温度削弱了C/N波动对硝态氮还原的抑制作用[31]，导致硝态氮还原量明显高于其他温度处理，不利于硝态氮对大肠杆菌产生毒害，同时温度对大肠杆菌代谢的影响对大肠杆菌的抑制作用比土壤C/N 对菌群产生的直接影响更显著。

4 结论

沼液施用后所有温度处理土壤中大肠杆菌数量均呈现先升后降的趋势。土壤温度为0.6 ℃时不利于大肠杆菌灭活，土壤温度为25 ℃时大肠杆菌灭活效果最好，土壤温度为37 ℃时利于大肠杆菌的扩繁。