RAC1对恶性肿瘤的调控作用及其分子机制研究进展

王琛瑶，梁百慧，吴锦源，唐梓涵，许小文，尹梓健，丁雅琼，方雄钊，李栢芝，文姝佚，程转，詹涵，张粤烽，王泫哲，何仕龙，张可洵，刘雅骐，周飞，熊兴东，白春英，许丽艳，李恩民，

(1.汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室，广东汕头515041；2.汕头大学医学院基础医学研究所，广东汕头515041；3.赤峰学院基础医学院，内蒙古赤峰024076；4.广东医科大学基础医学院，广东东莞523808；5.韩山师范学院生命科学与食品工程学院，广东潮州521041)

RAS相关C3肉毒杆菌毒素底物1(ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，RAC1)是Ras超家族中Rho亚家族的核心成员。人类的RAC1基因位于7号染色体短臂2区2带1亚带，含有两个转录本。编码RAC1蛋白的转录本长度为2 309 nt(NM_006908.5)，编码192个氨基酸；编码RAC1b蛋白的转录本长度为2 366 nt(NM_018890.4)，编码211个氨基酸。RAC1和RAC1b是高度同源的剪接变体，剪接亚型RAC1b在1999年首次被描述，包括了1个额外的外显子3b紧接在开关II区域后面，该外显子中插入了19个氨基酸，这种插入导致其核苷酸交换率增强并且延迟GTP水解，因此，在大多数细胞中，RAC1b处于GTP结合的活性状态，该剪切亚型可能不是肌动蛋白细胞骨架的直接调节因子，因此本文不予详述。RAC1主要存在于细胞质与细胞伪足处，这是RAC1蛋白参与细胞运动调控的形态学证据。RAC1是一种结构简单的GTP酶蛋白，其折叠方式由中心区域的β片层和周围是α螺旋组成，RAC1含有1个核心的结构域，即G结构域，该结构域含有5个一致性元件，主要位于其β片层的C端以及α螺旋的连接处，该位置组成了核苷酸的结合位点，其前3个一致性元件(P-loop、开关Ⅰ、开关Ⅱ)与GTP和GDP的结合有关。RAC1的功能高度依赖于其GTP结合态和GDP结合态之间的转换。前者是活性态，相当于开关的开启状态，介导相关细胞信号传导；后者是失活态，相当于开关的关闭状态，阻断相关细胞信号转导。RAC1蛋白的GTP结合态/活性态和GDP结合态/失活态之间的循环切换，受鸟嘌呤核苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factors，GEFs)、GTPase激活蛋白(GTPase-activating proteins，GAPs)和GDP解离抑制因子(GDP dissociation inhibitors，GDIs)三者的协同调控。通常情况下，RAC1主要处于与GDP结合的失活态，而锁定这种状态主要依靠GDIs。当接收到激活信号时，非蛋白酪氨酸激酶SRC受体(proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src，SRC)催化GDIs与RAC1-GDP之间的解离；而失活态RAC1-GDP在GEFs的作用下会生成激活态RAC1-GTP；激活态RAC1-GTP在GAPs作用下水解，生成失活态RAC1-GDP。以上被称为RAC1/GTPase循环，详见图1。

图1 RAC1/GTPase循环

1 RAC1对恶性肿瘤细胞增殖的调控及其分子机制

细胞增殖是生命活动的基本特征。正常细胞的周期分为4期，G1期为DNA复制做准备，S期进行DNA复制，G2期为有丝分裂做准备，M期为有丝分裂期。在细胞周期中，G1期的启动是关键。G1晚期有决定细胞周期的限制点，细胞需要接受生长因子的持续刺激，才能通过该限制点进入S期，否则进入相对静止的G0期。这些生长因子的刺激信号会通过活化细胞膜酪氨酸激酶受体(receptor protein tyrosine kinase，RTKs)、RAC1/PI3K/AKT、RAC1-PAKs以及RAC1/JNK/c-Jun等信号通路将细胞增殖信号传至细胞内部。而肿瘤恶性增殖的核心事件是正常的细胞周期进程被破坏，上述相关调控蛋白和信号转导通路发生改变，使肿瘤细胞接收一系列异常信号，顺利通过细胞周期限制点，进入细胞周期进程，失去分化能力，发生恶性增殖。因此，长期以来有关细胞周期信号通路的研究，一直是肿瘤学研究领域的热点。2018年发表的一项研究表明，激活胃癌细胞中的RAC1/PI3K/AKT通路可以通过影响细胞周期促进细胞增殖活力。2020年发表的研究表明，RAC1可以促进食管癌细胞的生存能力，在食管癌细胞中下调RAC1可以通过阻断phosphoinositide 3-kinase/AKT/mTOR通路来抑制食管癌细胞的增殖、侵袭和迁移。最新研究报道，转移性前列腺癌相关基因编码蛋白DEPDC1B能通过与RAC1结合，激活PAK1通路，诱导上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和促进细胞增殖，这种DEPDC1B介导的致癌作用可被RAC1-GTP抑制剂或

RAC1

基因沉默所逆转，该研究提示RAC1可能作为临床干预转移性前列腺癌的重要靶点。另有研究发现，c-Jun能对组织发育和疾病的不同信号进行串扰、放大和整合。在细胞内，c-Jun的转录活性调控可通过RAC1/SAPK/JNK对c-Jun的Ser63/Ser73磷酸化实现，RAC1会通过干扰RAC1/SAPK/JNK/c-Jun信号的传递，阻断正常细胞周期的进行，影响细胞的增殖。上述研究表明，抑制RAC1在肿瘤细胞中的异常过表达，能够阻断肿瘤细胞的恶性增殖。

2 RAC1对恶性肿瘤细胞迁移的调控及其分子机制

肿瘤细胞的迁移由4个步骤组成：头部细胞丝状伪足的形成和延伸以探测细胞运动的方向，紧接着细胞形成片状伪足并建立新黏附位点提供细胞向前运动所需的黏附力，最后胞体的收缩，以及细胞尾部的退缩完成一个细胞的运动周期。肿瘤细胞通过重复此4个过程不断向前迁移。在多条信号通路中，RAC1是关键的调控因子，处于中枢位置，主要参与对细胞骨架重组和细胞黏附基质的调控，进而控制细胞的迁移过程。细胞形态改变和细胞伪足的形成是细胞侵袭迁移的起始步骤，RAC1可通过调控其下游效应因子WASP(wiskott-aldrich syndrome protein，WASP)蛋白家族，诱发膜皱褶，促进片状伪足形成。新形成的片状伪足能与周围基质形成黏附连接，产生细胞向前运动的锚着位点。细胞迁移头部高度动态性伪足结构的形成依赖肌动蛋白单体聚合和肌动蛋白纤维的延长，WASP家族不同成员通过不同的结构域与RAC1结合而被活化。细胞伪足的形成还依赖另一种关键调节因子Cofilin，Cofilin可使肌动蛋白丝被切割，产生新的肌动蛋白丝末端。RAC1通过与二聚化的PAKs(p21 activated kinases)分子的结合域PBD结合，恢复PAKs活性。见图2，激活下游的效应分子LIMK1/2(LIM domain kinase 1/2)，进一步磷酸化Cofilin，使Cofilin失活，抑制肌动蛋白丝被切割，稳定肌动蛋白丝细胞骨架。新黏附位点的建立是细胞迁移的第2个步骤，细胞持续的迁移需依赖细胞伪足与细胞外基质(extracellular metrax，ECM)的稳定黏附，提供细胞向前迁移的牵引支点。迁移的细胞头部与ECM的黏附，以及尾部与ECM的去黏附不断交替使得细胞向前迁移，RAC1对这一过程发挥精确的调节作用。细胞表面的整合素受体与ECM中特异的配体结合，通过整合素聚集成簇而形成黏着斑复合物(focal adhesion complex，FAC)，并与细胞骨架相连，提供细胞迁移的锚着位点。活化的RAC1能激活PAK1，而PAK1能进一步磷酸化下游的黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)，促进新的FAC的形成。细胞胞体的收缩和细胞尾部的退缩是迁移最后的两个环节，这两个环节需要依靠张力纤维收缩和肌动蛋白丝的延长提供动力，RAC1可通过调节细胞骨架的重组，为细胞迁移提供动力。文献报道，抑制RAC1/PAK1/LIMK1通路的激活可衰减EMT，从而抑制胃癌细胞迁移和侵袭。一项2018年发表的研究表明，细胞内成熟的抗炎因子IL-37直接与RAC1的C端高变区CAAX基序结合，进而抑制RAC1膜易位及随后的下游信号传导，进一步抑制细胞的迁移。目前，已经明确RAC1在肿瘤的侵袭迁移中发挥非常关键的作用，RAC1可能作为评价肿瘤恶性程度与预测肿瘤侵袭迁移的新型标志物。有理由相信，随着相关研究的不断深入，RAC1在肿瘤侵袭迁移中的作用机制会愈加明确。

图2 RAC1-GTP激活下游效应蛋白PAKs机制示意图

3 RAC1对恶性肿瘤细胞代谢的调控及其分子机制

糖酵解信号通路由调控糖酵解代谢的关键酶组成，主要包括己糖激酶(hexokinase，HK)、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PKM1/2)、丙酮酸脱氢酶和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)等。有氧情况下，丙酮酸脱氢酶复合体在NAD存在下催化丙酮酸和CoA转化成乙酰-CoA和CO。在缺氧条件下，癌细胞或其他高度增殖的细胞，糖酵解产生的大部分的丙酮酸离开线粒体，通过乳酸脱氢酶的作用产生乳酸。一项2019年发表的研究表明，乳酸脱氢酶B第162位丝氨酸磷酸化会显著增加其将丙酮酸还原为乳酸的活性，解除了丙酮酸对底物的抑制作用，导致丙酮酸和NADH转化为乳酸和NAD的显著升高，从而促进肿瘤细胞的糖酵解和肿瘤生长。缺氧条件下，糖酵解产物乳酸可以激活癌细胞中许多信号通路，促进癌细胞的存活、侵袭、迁移、免疫逃逸和血管生成。乳酸脱氢酶的启动子含有HIF-1α结合位点，缺氧条件能诱导乳酸脱氢酶的表达，相关研究表明RAC1是HIF-1激活所必需的。2020年发表的一项研究结果表明，激活RAC1可以通过上调糖酵解，特别是非氧化磷酸戊糖途径，增加核苷酸代谢，引起乳腺癌细胞的化疗耐药；该研究提示，靶向RAC1是一种克服乳腺癌获得性化疗耐药的潜在策略。2019年发表的一项研究表明，在有氧条件下，抑制RAC1活性会通过抑制AKT/FOXO3a的磷酸化，影响糖酵解的关键酶PKM、LDHA和HK1的表达，进一步影响细胞代谢重编程。深入研究肿瘤细胞的代谢重编程相关分子机制对肿瘤的靶向治疗具有重要指导意义。

4 持续激活型RAC1与永久失活型RAC1

所谓的持续激活型RAC1，即RAC1蛋白能持续结合GTP，可持续向效应器发出信号产生激活效果，其经典的突变形式有RAC1V12，该突变型是RAC1蛋白的第12位氨基酸残基由甘氨酸G突变为缬氨酸V，详见图3(自绘模式图)，该位点突变后，可导致GAPs无法水解与RAC1结合的GTP，使RAC1处于持续的激活状态。所谓的永久失活型RAC1，即RAC1蛋白无法与GTP结合，阻止RAC1与相应效应物结合发挥作用，阻断该基因调控的信号转导。其经典的突变形式有RAC1N17，该突变型是RAC1蛋白的第17位氨基酸残基由苏氨酸T突变为天冬酰胺N，详见图3，该位点突变后，可阻止RAC1与GTP结合，抑制RAC1蛋白向下游效应器发出信号产生失活的效果，RAC1V12和RAC1N17是对比研究RAC1蛋白功能最常用的工具。RAC1在多种肿瘤中广泛存在着突变，激活型RAC1是驱动肿瘤恶性演进的重要因素。一项新近的研究阐述了RAC1在多种恶性肿瘤中存在的不同形式突变，在头颈癌中发现RAC1C18Y/C18F突变，在结直肠癌中发现RAC1C18Y突变，在睾丸癌中发现RAC1G12V突变，在前列腺癌中发现RAC1Q61R突变，在黑色素瘤中发现RAC1P29S突变，这些常见的突变大多发生在RAC1蛋白的关键结构域上，通过影响RAC1蛋白中P-loop、开关Ⅰ、开关Ⅱ的结构，进而影响RAC1蛋白与GTP/GDP的结合。Zeiz等报道在人体内RAC1P29S激活型突变与恶性黑色素瘤的耐药性和不良预后有关，该文提示，深入研究RAC1突变体调控细胞的分子机制，将有助于综合考虑RAC1信号通路的上游与下游诸环节，为开展肿瘤的联合分子靶向治疗研究提供理论依据。

图3 RAC1蛋白氨基酸残基位点G12V和T17N突变示意图

5 总结与展望

RAC1作为一个重要的小G蛋白，在肿瘤细胞通讯中发挥着重要的调控作用。RAC1通过对PAKs激酶、JNK级联信号通路和糖酵解信号通路等通路中重要靶标分子的调控，影响肿瘤细胞的增殖、迁移和代谢，进一步影响肿瘤的发生与发展。深入研究RAC1在恶性肿瘤演进中的分子作用机制，可为以RAC1为靶点，开展恶性肿瘤分子靶向抑制剂开发提供理论依据；同时也可为以RAC1及其信号通路上下游的效应物环节为分子靶点，开展恶性肿瘤联合分子靶向治疗研究提供理论指导。