基于BALB/c小鼠的局部淋巴结试验用于皮肤致敏性评价的实验研究

胡培丽，阮浩澜，贺抒，张杨，李波，邢书霞，孙磊，王钢力，

(1.中国食品药品检定研究院，北京100050；2.广东省药品检验所，广东广州510663；3.成都市食品药品检验研究院，四川成都610000)

小鼠局部淋巴结试验(local lymph node assay，LLNA)是皮肤致敏多种替代方法中应用最为广泛的方法之一，Takeyoshi等建立了基于掺入溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU)和酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)的LLNA改良方法(LLNA:BrdU-ELISA)，用示踪剂替代放射性标记物。LLNA和LLNA:BrdU-ELISA方法中均推荐使用CBA/JN小鼠，该品系小鼠在国内供应较少，价格昂贵；而BALB/c小鼠遗传稳定，在国内应用广泛，前期研究结果表明两品系小鼠只是反应程度有一定的差异，对化学物和化妆品致敏性判断及致敏强度分级并无显著影响。由于传统致敏性试验要避免受试物出现过度的皮肤刺激反应，因此本研究应用BALB/c小鼠LLNA:BrdU-ELISA方法对22种化学物和5种化妆品的皮肤刺激性和致敏性同时进行检测，并与相关传统试验数据进行比较，进一步对该方法进行评价。

1 材料与方法

1.1 受试物

溶剂为丙酮/橄榄油(acetone/olive oil，AOO)[按4∶1(V/V)配制而成]、丙酮(acetone，ACE)、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)或蒸馏水。2,4-二硝基氯苯、间苯二甲酸二甲酯、丁子香酚、异丁子香酚、3-氨基苯酚、反式肉桂醛、己基肉桂醛、水杨酸甲酯、香叶醇、对苯二酚、水杨酸己酯、水杨酸、甲醛、戊二醛、六水硫酸镍、二氯化钴、重铬酸钾和乳酸均购自Sigma公司；异丙醇、丙二醇、正己烷和苯购自国药集团化学试剂有限公司。5种化妆品为超市随机采购，标识齐全，成分标识清晰，使用说明明确。

1.2 实验动物

SPF级BALB/c小鼠，雌性，8～10周龄，由中国食品药品检定研究院实验动物资源中心提供，合格证号为SCXK(京)2014-0013。动物试验环境为屏障系统动物房，使用许可证号为SYXK(京)20160004，温度(22±2)℃，湿度40%～60%，动物自由饮食，12 h人工照明。

1.3 试剂和仪器

BrdU粉 剂、BrdU-ELISA试 剂 盒 购 自Roche公司，BrdU粉剂用生理盐水配成10 mg/mL标记液。SYNERGY HT全自动酶标仪购自美国Bio-Tek公司。

1.4 试验方法

1.4.1 动物分组和染毒

试验设溶剂对照组(AOO、ACE、DMSO或蒸馏水)，阳性对照组(25%己基肉桂醛)和受试物组，上述22种化学物用AOO、ACE或DMSO配成1~3个不同浓度，参照美国替代方法验证机构间协调委员会(Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods，ICCVAM)，5种化妆品产品原液直接涂抹于小鼠双侧耳背，每组4只小鼠。于试验第1~3天上午9:00在小鼠双耳背部分别涂抹受试物25 μL，溶剂对照组涂抹相应溶剂，第4天不作处理，第5天腹腔注射BrdU标记液0.5 mL。

1.4.2 取材

BrdU标记液腹腔注射24 h后，摘取小鼠双侧耳朵，用直径9 mm的打孔器进行耳廓中央打孔称取质量，同时分离小鼠耳部双侧淋巴结，用天平称量湿质量。

1.4.3 淋巴细胞制备

双侧淋巴结用1 mL PBS研磨，200目不锈钢筛网过滤，同时用1 mL PBS冲洗不锈钢筛网，制成2 mL单细胞悬液，将每只小鼠的淋巴细胞用50 mL离心管定容于15 mL PBS中。

1.4.4 ELISA法检测细胞增殖

将100 μL细胞悬液加入96孔板中，300 g离心10 min，弃上清，吹干细胞；加200 μL变性固定液，反应30 min，弃去变性固定液；加100 μL抗-BrdU抗体工作液，室温孵育90 min；弃掉未结合的工作液，用PBS洗液清洗3次，加底物显色液100 μL，室温反应20 min，用酶标仪测吸光度(发射波长、参考波长分别为370和492 nm)。

1.4.5 刺激指数、EC值计算与致敏性分级

刺激指数(stimulation index，SI)为受试物组BrdU标记指数均值与溶剂对照组BrdU标记指数均值的比值，SI≥1.6为致敏阳性。根据SI值估算SI为1.6时受试物的浓度(estimated concentration needed to produce an SIof 1.6，EC)，公 式 为：①EC=c+[(1.6-d)/(b-d)]×(a-c)(受试物3个浓度含SI>1.6和SI<1.6)；②EC=2(受试物3个浓度均为SI≥1.6)，其中a、c为相邻两点受试物的浓度，b、d为相应SI值。致敏强度分级标准为：EC<0.1为极强，0.1≤EC<1.0为强，1.0≤EC<10为中，10≤EC<100为弱。

1.5 LLNA:BrdU-ELISA结果与传统实验数据的比较

22种化学物和5种化妆品LLNA:BrdU-ELISA法BALB/c小鼠的致敏性检测结果与LLNA:BrdU-ELISA法CBA小鼠、LLNA放射法、经典豚鼠(guinea pig，GP)法及人体实验文献数据比较。

1.6 致敏性检测结果评价分析

依据ICCVAM文献中化学物的已知致敏性，评价BALB/c小鼠LLNA:BrdU-ELISA法致敏性检测的阳性预测率、阴性预测率、假阳性率、假阴性率、灵敏度、特异度和准确度。

1.7 统计学方法

计数每剂量组小鼠的耳廓质量、淋巴结质量和BrdU标记指数的均值与标准差，用

x

ˉ±

s

表示，用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析。组间比较采用成组方差分析，以

α

=0.05为检验水准，

P

<0.05为组间差异有统计学意义。

2 结果

2.1 22种化学物和5种化妆品皮肤刺激性

50%己基肉桂醛、5%二氯化钴、10%乳酸、25%乳酸、50%乳酸组耳廓质量与相应溶剂对照组比较差异有统计学意义(

P

<0.05或

P

<0.01)，为刺激阳性，其他剂量组化学物均为刺激阴性。5种化妆品中，2号染发剂组耳廓质量与溶剂对照组比较差异有统计学意义(

P

<0.05)，为刺激阳性；其他化妆品均为刺激阴性(表1)。

表1 22种化学物和5种化妆品LLNA:BrdU-ELISA(BALB/c)法皮肤刺激性和致敏性测定结果

(续表1)

2.2 22种化学物和5种化妆品皮肤致敏性

2,4-二硝基氯苯、丁子香酚、异丁子香酚、3-氨基苯酚、反式肉桂醛、己基肉桂醛、香叶醇、对苯二酚、水杨酸己酯、甲醛、戊二醛、六水硫酸镍、二氯化钴、重铬酸钾、乳酸和2号染发剂为致敏阳性(SI>1.6)，致敏强度分级见表1；其他组SI值均小于1.6，为致敏阴性，见表1。

2.3 LLNA:BrdU-ELISA结果与文献数据比较

查阅相关文献中的数据，异丙醇LLNA法与GP豚鼠法均为致敏阴性，与本研究结果一致，但LLNA:BrdU-ELISA法CBA小鼠同时也有致敏假阳性结果，且人体实验为致敏阳性；正己烷LLNA:BrdU-ELISA法CBA小鼠检测结果为致敏假阳性，而本研究BALB/c小鼠、LLNA放射法及人体实验结果均为致敏阴性，较一致；乳酸LLNA放射法、豚鼠法及人体实验结果为致敏阴性，而LLNA:BrdU-ELISA法CBA小鼠结果为致敏阴性或阳性，而本研究BALB/c小鼠结果亦为致敏阳性，均为假阳性。苯为全新化学物，ICCVAM文献中无相关致敏性数据。其他化学物BALB/c小鼠致敏结果均与相关文献一致(部分化学物某些实验数据未知除外)，个别化学物致敏级别稍有差异。5种化妆品BALB/c小鼠致敏结果与传统的豚鼠实验结果一致。22种化学物和5种化妆品LLNA:BrdU-ELISA(BALB/c)法检测的致敏性结果与LLNA:BrdU-ELISA(CBA)、LLNA放射法，经典豚鼠法、人体试验文献数据比较见表2。

表2 22种化学物和5种化妆品LLNA:BrdU-ELISA(BALB/c)法检测的致敏性与文献数据的比较

2.4 致敏性检测结果评价分析

苯为全新化学物，ICCVAM文献中无相关致敏性数据。依据其他21种已知致敏性化学物，评价BALB/c小鼠LLNA:BrdU-ELISA法的致敏性检测结果：阳性预测率为93.3%(14/15)、阴性预测率为100%(6/6)、假阳性率为14.3%(1/7)、假阴性为0(0/14)、灵敏度为100%(14/14)、特异性为85.7(6/7)、准确度为95.2%(20/21)，见表3。

表3 BALB/c小鼠LLNA:BrdU-ELISA方法致敏性检测结果评价分析

3 讨论

由于实验动物的种属、性别、年龄等因素会影响实验结果及评价体系，所以选择合适的动物进行实验尤为重要。经济合作与发展组织(Organization for Economic Co-operation and Development，OECD)指南(TG429、TG442)推荐CBA小鼠，但该品系小鼠在国内使用量较少，繁殖周期较长、价格较高，不易推广应用；而BALB/c小鼠在国内应用较为广泛，遗传背景明确稳定，是替代CBA小鼠的较好选择。前期研究对两品系小鼠LLNA:BrdU-ELISA法结果进行了比较，结果表明两个品系小鼠均可较好地评判化学物或化妆品的致敏性及致敏强度分级。

由于刺激物和致敏物均可对淋巴细胞产生增殖作用，从而致使LLNA产生假阳性，目前有研究通过增选刺激性指标(耳廓质量、耳厚差)对化学物的刺激性和致敏性进行全面评价。但测量耳厚差主观性较强，误差较大，不易操作，所以本研究选用称量耳廓质量来评价受试物的刺激性。

本研究选用BALB/c小鼠LLNA:BrdU-ELISA法对22种化学物和5种化妆品进行评价，通过耳廓质量评价受试物的刺激性，通过淋巴结质量、BrdU指数(SI)和EC评价受试物的致敏性及致敏强度。刺激性结果显示50%己基肉桂醛、5%二氯化钴、10%乳酸、25%乳酸、50%乳酸和2号染发剂为刺激阳性；而ICCVAM文献中乳酸(≥10%，兔试验)、己基肉桂醛(>10%，豚鼠试验)和5%二氯化钴(豚鼠试验)为刺激阳性，2号染发剂传统皮肤刺激性试验(兔)结果为刺激阳性；以上结果表明用耳廓质量评价受试物的刺激性较为客观、科学、准确。

致敏性结果与传统实验比较：异丙醇与正己烷为非致敏物，本研究结果与LLNA发射法均为致敏阴性，而ICCVAM中CBA小鼠结果为致敏假阳性，表明LLNA:BrdU-ELISA法CBA小鼠反应更为灵敏。前期两品系小鼠比较研究中也发现CBA小鼠较BALB/c更高程度地摄取BrdU，反应程度有一定的差异，该发现与国际上相关学者对不同品系小鼠LLNA研究结果较一致。乳酸亦为非致敏物，但本研究与LLNA:BrdU-ELISA法CBA小鼠结果均为致敏假阳性，可能是乳酸的刺激性引起了淋巴细胞增殖，有待于进一步分析淋巴细胞表型，并开展深入研究。

该方法阳性预测率为93.3%、阴性预测率为100%、假阳性率为14.3%、假阴性率为0、灵敏度为100%、特异性为85.7%、准确度为95.2%，表明BALB/c小鼠LLNA:BrdU-ELISA法较好地评价了化学物/化妆品的皮肤致敏性，可在化妆品安全性评价中推广应用，发挥其重要作用。