潮汕地区汉族人群MTHFR基因rs1801131多态性与非综合征型唇腭裂的相关性研究

陆雪梅，许铭炎，刘庭英，张秋芳，邓小玲

(1.厦门医学院附属口腔医院，厦门市口腔疾病诊疗重点实验室，福建厦门361003；2.厦门大学医学院基础医学部，福建厦门361102；3.汕头大学医学院第二附属医院唇腭裂中心，广东汕头515041)

非综合征型唇腭裂(nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate，NSCL/P)是指不伴有其他先天畸形的唇腭裂。根据临床表现，可以分为单纯性唇裂(cleft lip only，CLO)、单纯性腭裂(cleft palate only，CPO)以及唇裂伴腭裂(cleft lip with palate，CLP)。NSCL/P是全世界最常见的先天畸形之一，发病率在不同民族和地理区域之间存在较大差异，在中国，NSCL/P的发病率约为1.42‰。

NSCL/P是一种受遗传和环境因素交互作用的遗传性疾病，其潜在的遗传因素及分子机制尚不清楚，研究发现许多基因参与了NSCL/P的发生，如干扰素调节因子6(interferon regulatory factor 6，IRF6)、肌肉片段同源盒1(muscle segment homeobox 1，MSX1)、转化生长因子-β(transforming growth factor β，TGF-β)、5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(5,10-methylenetetrahydro⁃folate reductase，MTHFR)和叉头框E1(forkhead box El，FOXE1)等，其中MTHFR基因被认为是NSCL/P的一个易感候选基因，引起广泛关注。MTHFR基因定位于染色体1p36.3，编码亚甲基四氢叶酸还原酶，在生物体叶酸代谢过程中起重要作用。而叶酸参与细胞的增殖生长及核酸、氨基酸、蛋白质的合成等过程，有研究显示叶酸缺乏或代谢障碍会使DNA不能正常甲基化，导致多种神经管缺陷，因此MTHFR基因多态性被认为与多种出生缺陷疾病有关，受孕早期补充叶酸可降低后代唇腭裂发病率，服用叶酸预防NSCL/P也被广大父母所认同。

MTHFR基因与NSCL/P的发病是否相关尚未得到一致结论。据报道在MTHFR基因上有多个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)位点与NSCL/P有 关，其 中rs1801131位 点(A1298C)和rs1801133位点(C677T)较为常见，但在不同地理区域和不同民族中存在差异。多篇研究发现MTHFR基因rs1801133多态性与NSCL/P相关，该基因突变能够增加中国汉族人群罹患NSCL/P的风险。而MTHFR基因rs1801131多态性与NSCL/P的关系报道相对较少，尚无一致的结论。MTHFR基因rs1801131位点多态性是指1298A→C(腺嘌呤→胞嘧啶)基因突变，使编码后的谷氨酸被丙氨酸替代，导致MTHFR酶活性和热稳定性降低，影响细胞内叶酸正常代谢、DNA合成反应及甲基化，破坏基因组的稳定性及完整性，进而增加了NSCL/P的易感性。本研究采取病例对照、传递不平衡及家系分析等方法对中国潮汕地区汉族人群MTHFR基因rs1801131位点多态性与NSCL/P易感性的相关性进行探讨。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集2008—2011年间潮汕地区汉族非综合征NSCL/P患者357例、患儿父亲199例和患儿母亲198例及其来自同地区健康志愿者354名为正常对照组，均已排除三代以内家族性唇腭裂遗传史，基本资料见表1。此研究所有参与者均已签署知情同意书，并通过汕头大学医学院伦理委员会批准。

表1 病例组与对照组的基本资料

1.2 DNA提取及基因分型

采集研究者外周血5 mL，EDTA抗凝后使用DP318-血液基因组提取试剂盒(北京天根生化科技公司)，按照试剂盒说明书操作提取外周血白细胞基因组DNA；采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)技术进行基因分型。

1.3 统计分析

应用SPSS 13.0软件进行统计分析，采用χ检验对资料进行Hardy-Weinberg平衡检测，比较各组基因型及等位基因频率的差异(检验水准设为α=0.05)，并计算OR值及其95%可信区间。对双亲中至少一方含有杂合子的核心家庭进行等位基因传递不平衡检验(transmission disequilibrium test，TDT)。对 所 有 的 基因多态性遗传资料应用FBAT 2.0.2软件(www.biostat.harvard.edu/fbat/default.html)进行家系分析。

2 结果

2.1 基因型分布的Hardy-Weinberg平衡检验

病例组和对照组人群的平衡检测结果如表2所示，均符合Hardy-Weinberg平衡检验，可确认样本具有群体代表性。

表2 Hardy-Weinberg平衡检验

2.2 基因型及等位基因在病例组、双亲组和对照组的分布和比较

利用MALDI-TOF-MS技术，实现了

MTHFR

基因rs1801131位点多态性的高通量分型，其基因型与等位基因在病例组、双亲组和对照组的分布频率如表3所示。卡方检验的结果显示所有病例组、单纯唇裂组、单纯腭裂组和唇裂伴有腭裂组的基因型及等位基因分布与对照组比较差异均无统计学意义(

P>

0.05)。评估每种基因型相对风险度的比值比(OR值)发现各组人群中CC和AC基因型携带者相对于AA基因型携带者的OR值的95%可信区间(CI)均包含1，这说明携带一个或者两个突变等位基因，并不能显著提高或者降低唇腭裂的患病风险。以上病例-对照研究的结果提示

MTHFR

基因rs1801131位点基因型多态性和等位基因多态性与NSCL/P的发病风险不存在相关性。

表3 基因型及等位基因分布

2.3 TDT检验

对含有杂合子信息双亲的核心家庭(135例)进行TDT分析，结果如表4所示，在

MTHFR

rs1801131位点父母传递给患病子女的等位基因A和C分别为62个和73个，卡方检验显示该位点等位基因与NSCL/P患者之间未发现有连锁不平衡存在(

P

>0.05)。

表4 MTHFR rs1801131位点等位基因传递不平衡检验

2.4 家系分析

为了进一步利用

MTHFR

rs1801131位点杂合子和纯合子的遗传信息，运用家系关联性分析软件对109个核心家庭遗传信息进行分析，结果见表5，发现

MTHFR

rs1801131位点的等位基因A或C在病例组和单纯唇裂组、单纯腭裂组和唇裂伴有腭裂组的分布差异均无统计学意义(

P

>0.05)。

表5 MTHFR rs1801131位点家系分析

3 讨论

潮汕地区位于广东省东南沿海，由于历史和地理的原因，形成了一个具有特殊风俗习惯和方言的汉族群体，拥有与中国其他地区的汉族群体不同的分子遗传信息。本研究利用高通量基因分型技术，对潮汕地区汉族人群的

MTHFR

rs1801131位点的基因多态性进行分型，并对NSCL/P发病的遗传相关性进行研究。NSCL/P的发病机制尚未阐明，普遍认为NSCL/P是遗传基因和环境相互作用的具有遗传易感性的疾病，基因的多态性变异是主要致病因素之一，筛选NSCL/P的易感基因有助于为NSCL/P的检测和预防提供科学依据。

本研究首先对病例组和对照组人群基因型分布进行Hardy-Weinberg检验，结果人群并未偏离Hardy-Weinberg定律(P>0.05)，提示本研究所收集的样本信息具有一定的代表性，能够代表潮汕地区汉族人群。利用病例-对照研究，在等位基因频率分布中我们发现病例组和病例父母组与对照组中rs1801131位点等位基因和基因型的分布相似，且等位基因C的频率均在20%左右；TDT检验发现rs1801131位点A等位基因在唇腭裂患者中不存在传递(P>0.05)；进一步利用家庭为基础的相关性分析，证实了rs1801131位点的A等位基因或C等位基因的分布频率与唇腭裂的发病并无显著相关关系。所有这些研究表明潮汕地区汉族人群MTHFR基因rs1801131位点的多态性与NSCL/P不存在相关性，该结论与李三华等报道一致，而与Han等研究结果不一致，这可能与研究人群、基因分型方法和样本量等影响因素相关。

传统的唇腭裂相关候选基因关联性分析是通过病例-对照研究设计，这种研究设计不能避免人口混杂造成的统计偏倚。而这种混杂偏倚不同于多种环境因素引起的偏倚，即使采用分层分析或多因素回归分析也不能有效控制这类偏倚，最终可能导致基因与疾病虚假的关联信息。利用TDT检验和以家庭为基础的相关性分析可避免上述人口混杂造成偏倚，本研究通过TDT检验和FBAT检验不仅充分利用核心家庭和家系资料进行遗传分析，而且从不同角度进一步验证MTHFR基因rs1801131位点的多态性与NSCL/P病例-对照相关性研究的结果，使得结论更有说服力，是值得推广和应用的家系统计分析方法。

PCR是常用检测SNP位点的方法，具有技术简便的特点，能够对已知SNP位点进行区分，但只适用于少量样本的检测，检测大样本量的SNP位点时有一定的限制，而MALDI-TOF-MS技术利用质谱分析对分子量的灵敏度特别高，通过区分单碱基不同的两段基因序列，对SNP位点进行分型，能实现多个SNP位点进行大规模的人群筛查。本研究正是利用该技术对MTHFR基因rs1801131位点进行快速、准确地基因分型。

总之，本研究利用病例-对照、TDT和家系分析等多种遗传分析的方法发现潮汕地区汉族人群MTHFR基因rs1801131多态性与NSCL/P患病风险无显著相关性，提示MTHFR基因rs1801131多态性可能不参与中国潮汕地区汉族人群唇腭裂的发生。