人群PIG-A基因突变测定的研究进展

李蕊瑞，张立实，陈锦瑶，

(1.四川大学华西公共卫生学院卫生毒理与病理学系，四川成都610041；2.四川大学华西公共卫生学院营养与食品卫生学系，四川成都610041)

磷脂酰肌醇聚糖A类基因((phosphatidylinositol glycan class A gene，PIG-A)(人类和其他灵长类中为PIG-A，啮齿动物中为Pig-a)，参与糖基磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidyl inositol，GPI)连接蛋白合成，在不同种属间具有高度保守性。至少有22个基因参与细胞表面的GPI连接蛋白的生物合成，但只有PIG-A基因位于性染色体，由于女性体内成对的X染色体有一条随机失活，相比其他位于常染色体上的基因，PIG-A基因突变更易引起GPI表型缺失。研究证实GPI连接蛋白的缺失与PIG-A基因突变具有对应关系，因此，PIG-A基因突变试验检测目标细胞表面GPI连接蛋白表型缺失，该方法灵敏、微创、可重复采样、高通量、有较长的检测窗、操作简便。最先被用作诊断阵发性睡眠性血红蛋白尿(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH)的金标准，此后有动物试验和体外试验用于遗传毒理学领域，自2011年人成熟红细胞(red blood cell，RBC)的PIG-A基因突变检测首次被报道后，人群PIG-A基因突变测定相关研究被尝试用于人体真实暴露于复杂环境因素的风险评估。

目前，多家实验室已建立了动物试验或体外试验方法，用于化学物遗传毒性的检测，各实验室间有良好的重现性和技术可转移性，已建立Pig-a试验结果的公共数据库。国际人用药物注册技术协调会议M7指南将Pig-a基因突变试验列入药物杂质遗传毒性试验中细菌诱变试验结果阳性的追加试验。而人群PIG-A突变测定尚在探索中，与动物试验和体外试验相比，其优势在于：①样品来自人体，可避免动物试验结果外推到人的不确定性；②可反映人群真实暴露下的健康效应；③可评估动物模型等无法模拟的暴露效应和真实环境的混合暴露效应，有助于扩大待评估的危险因素范围。本文将从人群PIG-A基因突变测定方法、突变水平、影响突变的因素及应用现状进行综述。

1 人群PIG-A基因突变测定方法及突变水平

1.1 PIG-A基因突变测定方法

PIG-A基因突变的检测方法有流式细胞术(flow cytometric methods，FCM)和有限稀释法。流式细胞术用荧光抗体标记目标细胞的GPI连接蛋白，用流式细胞仪定量检测；部分研究用带磁珠的抗体将数量相对较少的目标细胞群富集，研究证实有或无免疫磁珠富集的情况下检测的PIG-A基因突变率高度相关(r=0.973)。此外，也有研究通过梯度离心和细胞分离液分离出粒细胞进行检测。有限稀释法以产气单胞菌溶素作为选择剂通过细胞培养分选并扩增突变细胞，后续可进行基因水平的检测。

1.1.1 目标细胞

研究表明骨髓来源的细胞没有额外优势。现有研究主要分析了外周血来源的网织红细胞(reticulocyte，RET)、RBC、粒细胞、淋巴细胞的人群PIG-A基因突变率。结果表明RET的PIG-A基因突变率高于RBC，RET在早期的敏感性优于RBC；且该细胞有细胞核，不受补体介导的溶血的影响，可相对准确反映突变率。但外周血中RET只占红细胞总数的0.5%~1.5%，检测耗时。部分研究通过免疫磁珠富集RET提高检测效率，但也增加了实验步骤和成本。相比之下，RBC量大易得，但检测窗相对RET晚，无核DNA，易受补体攻击发生溶血。与RET相比，

PIG-A

基因突变率在RBC中被低估，且随着突变率增加，RBC会大大低估突变率。但有研究证实RBC和RET自发GPI表型缺失率的趋势一致、相关性较好。而粒细胞中

PIG-A

基因突变率的检测先从外周血中获得纯化粒细胞，再进行流式细胞术检测，较为复杂。综上，RET是研究者推荐的

PIG-A

检测的首选目标细胞。从组织中分离细胞极易损伤细胞表面标记，不利于识别位于细胞表面的GPI连接蛋白缺失，因此对实体组织分离的细胞的检测尚未见报道。不过，有研究者在体外模型中采用了HepG2细胞检测

PIG-A

基因突变，证实苯并(a)芘等可引起HepG2细胞的突变率显著增加，可作为体外遗传毒性测试的实体组织来源的细胞模型。目前建立的GPI传感器检测

PIG-A

突变的方法设计了荧光蛋白在GPI合成过程中进行标记，不需要对细胞表面抗体染色，以此为例的新方法的应用可能有助于拓宽可检测的细胞类型，从而增加该方法在人群中应用时的器官水平的遗传毒性终点。

1.1.2 染色方案

研究目的、目标细胞及不同成熟程度细胞表面标记的特异性表达差异会影响抗体和目标细胞的选择。文献中总结了目前的抗体组合。测定人群

PIG-A

基因突变水平较为成熟的方法是FCM，推荐以抗人CD235ab-APC标记红细胞、以抗人CD59-FITC标记GPI连接蛋白。PNH诊断多采用嗜水气单胞菌溶素变异体(aeromonas hydrophila lysin variant，FLAER)标记粒细胞和单核细胞；因为FLAER可以和所有白细胞的GPI位点结合，相比于CD59标记，能更敏感地检测GPI缺失表型，但也仅限于白细胞。因此有研究者认为同时检测2种不同细胞谱系和2种不同GPI锚链蛋白有助于降低假阳性率。也有研究者通过检测CD59、CD55、CD24均为阴性的细胞降低假阳性率。现有关于健康人群的

PIG-A

基因突变测定的方法和结果见表1。

表1 健康人PIG-A基因突变测定结果

1.2 人群PIG-A基因突变水平

由表1可知正常人RBC和RET的

PIG-A

基因突变率均值均小于1.0×10，而粒细胞和T细胞的

PIG-A

基因突变率均值约高出10倍；淋巴细胞

PIG-A

基因突变率分布范围较宽(1×10~1×10)。多项研究表明健康人

PIG-A

基因突变率个体内变异小而个体间变异大，且存在个别异常高值。有结果显示健康受试者RBC中PIG-A基因突变率相差可超过30倍，RET中相差约20倍。有研究将人群突变率和变异与实验动物的作了比较，发现人的基线值高于大鼠检测值的90%置信区间上限，且数据的变异较大。

2 PIG-A基因突变的影响因素

2.1 年龄

健康人中PIG-A基因突变率在各年龄段相对稳定。研究发现217名健康人的突变率与年龄无线性相关；在对其中3名健康人在300多天内多次检测后发现：同一个体的突变率变化较小；研究者认为原因是红细胞寿命有限，且由突变了的造血祖细胞在不断更新，所以在较长时间里没有累积性。另外97名健康人的年龄与PIG-A基因突变率的相关性较差。在铀暴露的退伍军人中也发现PIG-A基因突变率与年龄无关。但有研究表明52名健康人的RET和RBC的PIG-A基因突变率与年龄呈正相关，而且同一个体的突变率在不同时点变异较小。另一项研究也表明健康人RBC的PIG-A基因突变率与年龄呈正相关。

2.2 性别

莱昂效应指出女性体内有一条X染色体随机失活，位于X染色体上的PIG-A基因突变率应无性别差异。但Dobrovolsky等发现拉丁裔男性的中位数突变率低于女性；Cao等在亚裔健康人的研究中发现RBC中的PIG-A基因突变率在男性中高于女性，职业性铅暴露人群中RBC中的PIG-A基因突变率也有性别差异(男高于女)；Dertinger等发现女性的RET中PIG-A基因突变率略高于男性，但差异无统计学意义。另一项研究(n=300)也表明RBC的突变率在女性中较高，但不同性别间差异无统计学意义。

2.3 种族

目前对多人种正常人PIG-A基因突变率的研究尚未见报道。仅在一项存在铀暴露的退伍军人中的报道涉及非裔、亚裔、拉美裔、印第安人、高加索人，但该研究对此未作进一步分析，尚无法得知人种差异对PIG-A基因突变率的影响。

2.4 突变来源

突变发生阶段以及具有突变表型细胞成熟过程对不同时间点测得的突变率可能造成影响。Hu等指出健康个体中的PIG-A基因突变发生在分化的祖细胞水平，而非干细胞水平。目前尚未在健康人中检测到发生了PIG-A基因突变的造血干细胞，但健康人中GPI表型缺失细胞却持续存在。而非自发的PIG-A基因突变主要发生在造血干细胞中，干细胞来源的突变红细胞可在血液中持续蓄积，相比于造血祖细胞来源的突变表型，造血干细胞来源的突变表型持续时间更长；而在造血祖细胞发生突变时，在外周血中出现突变表型的时间要早于来自造血干细胞的突变。

2.5 行为方式和营养

研究表明PIG-A基因突变与是否吸烟、吸烟年限无关。动物试验发现营养不良会增加Pig-a基因突变率，肥胖可通过引起代谢障碍、炎症、氧化应激使得Pig-a突变率增加，但一项横断面研究(n=300)中发现PIG-A基因突变率与BMI、水果摄入量、肉类摄入量无关，但与低蔬菜摄入量有关。上述研究提示该方法或可用于检测非化学因素的致突变效应，但对结果的不一致需进一步探讨。

2.6 其他

治疗等干预措施会影响PIG-A基因突变测定结果，Araten等指出PNH患者中RBC的PIG-A基因突变率受到了输血的影响；发生溶血或接受输血治疗后，RBC中突变数量可被低估。有研究者推测启动子区域甲基化会导致PIG-A基因表达减少，从而影响GPI连接蛋白的产生，但尚未被证实。此外，炎症和与炎性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)相关的细胞分裂增加可能会导致IBD患者PIG-A基因突变率升高。

3 PIG-A基因突变测定在人群中的应用

使用了咪唑硫嘌呤治疗的36名IBD患者的PIG-A基因突变率比同期健康对照组高，但其突变率与该药物的治疗时间或总暴露量无关。该团队发现267名铅接触工人的PIG-A基因突变率[(10.9±10.7)×10]高于健康对照，且与累积血铅水平相关。一项横断面研究却表明PIG-A基因突变率均未随铅的暴露量和累计暴露量增加而变化，被检测的2 634名研究对象 的PIG-A基因突变率的均数为6.0×10(P=3.0×10，P=10.0×10)，研究者认为可能的原因是铅可引起DNA或染色体损伤，但不具诱变作用。另一项研究中，27名平均年龄为61.9岁(26~81岁)的不同类别癌症患者RBC的PIG-A基因突变率在0~49.67×10之间，个体间差异较大，其中2名患者使用了有遗传毒性的吉西他滨或喃氟啶化疗后，突变率明显高于健康对照，但因缺乏基线数据而因果难明。该研究中，突变率与健康人无明显差异的患者也有其他使用了有遗传毒性药物的化疗史，但未对此进行进一步研究。30名乳腺癌患者在放疗前、放疗后3周以及停止治疗后10周进行了PIG-A基因突变测定，结果表明，放疗未能诱导粒细胞的PIG-A基因突变率增加，研究者认为可能是不同试验方法的灵敏度、研究对象和干预措施的异质性等影响了实验结果。Cao等研究发现使用顺铂和依托泊苷联合治疗的患者RBC中的PIG-A基因突变率约增加了3倍。这提示可以通过测定PIG-A基因突变反映人体细胞异常突变，但仍需进一步研究。

4 总结与展望

综上，近年来已有少量关于人群中PIG-A基因突变的报道，RET是首选的目标细胞。文献报道的健康人PIG-A基因突变率的个体间变异大，PIG-A基因突变率与年龄、性别等因素的关联尚无一致结论，更多潜在的影响因素仍在探索中，目前在非健康人群中开展的相关研究尚不能得到确切的结论。且现有研究的样本量均较小，研究因素与PIG-A基因突变率的相关性在不同研究间并不一致，因此，有必要进行更大样本量的人群研究，获得人群的基线水平，明确机体因素和环境因素对个体间变异的作用；并纵向收集暴露前后数据、设同期健康人群对照，优化研究设计并建立标准的方法和体系，以便该方法用于人群真实的环境暴露风险评估。