抗虫耐除草剂玉米对大鼠的亚慢性毒性研究

周殿明，张大龙，张静，何宁，高峥，张倩，周晓丽，钱智勇

(天津市疾病预防控制中心毒理科，天津300011)

玉米已经成为仅次于小麦和水稻的第三大谷类作物，是全世界多个国家的重要粮食和经济作物。但是，许多生物或非生物的影响，如害虫、自然气候和杂草等，往往会对玉米产业造成巨大损失。近年来，生物技术尤其是转基因生物技术的发展为玉米育种在抗除草剂和抗病虫害方面提供了一条新的解决途径。

本研究使用的转基因玉米中转入cry1Ab、cry3Bb、cp4epsps、ZmHPT和ZmTMT 5个 基 因。cp4epsps基因来自农杆菌CP4菌株，能够编码产生新的芳香氨基酸生物合成用蛋白，该蛋白对草甘膦的亲合力大大降低，从而能使植物产生草甘膦抗性。Cry1Ab和Cry3Bb均属于Bt类蛋白，Bt蛋白由苏云金芽孢杆菌产生。Cry1Ab可以抵御欧洲玉米螟，西南玉米螟和亚洲玉米螟等鳞翅目害虫。Cry3Bb主要作用于玉米双斑萤叶甲等鞘翅目类昆虫。但是，Bt蛋白本身对人类没有任何毒性。ZmHPT来自玉米本身，可以提高植物体内的维生素E总含量。ZmTMT同样来自玉米，可以把低活性的γ-生育酚转化为高活性的α-生育酚。两个基因的结合可以显著提高玉米的α-生育酚含量，满足动物饲料的需要。本转基因玉米产品转入5个基因后，使其具有抗虫、抗草甘膦以及高维生素E含量的特性，具有重要的食用和经济价值，其安全性评价也就具有重要意义。

但是，转基因生物的安全问题，即是否具有潜在的人体危害已经受到全球范围内广泛关注，成为社会热点问题。因此转基因生物的食用安全评价也成为该领域的重要工作。近年来，转基因玉米的食用安全性评价已开展了大量研究工作，主要包括理化实验和毒理学实验。虽然大部分转基因玉米经过食用安全性评估表明其不具有不良反应，但是每一个新的转化事件的安全性仍需要根据个案评估的原则进行研究。本研究依据“实质等同性”原则，按照《NY/T 1102—2006转基因植物及其产品食用安全检测：大鼠90 d喂 养 试 验 标 准》对 转cry1Ab、cry3Bb、cp4epsps、ZmHPT和ZmTMT基因抗虫耐除草剂玉米进行了大鼠90 d喂养实验，了解分析该转基因玉米是否会对大鼠产生亚慢性毒性作用，为该转基因玉米的食用安全性评价提供一定的实验数据。

1 材料与方法

1.1 样品

转cry1Ab、cry3Bb、cp4epsps、ZmHPT和ZmTMT基因抗虫耐除草剂品质性状改良玉米和非转基因对照(亲本)玉米样品2~8℃条件下储存。

1.2 主要仪器和试剂

Sysmex XT-2000i五分类血球计数仪，TOSHIBA TBA-40FR全自动生化分析仪，徕卡EG1140H+C包埋机，徕卡2145切片机，徕卡HI1201摊片机，徕卡ASP300脱水机，Olympus BX53DP72病理图像分析系统，赛多利斯CP323S电子天平，赛多利斯TE6100-L电子天平。全自动血液分析仪专用试剂(天津鼎信医疗科技有限公司)，血生化检测试剂盒(北京九强生物技术有限公司)。

1.3 实验动物和饲养条件

选取SPF级Wistar大鼠140只，6周龄，雌雄各半。实验在天津市疾病预防控制中心SPF级动物房中进行。环境温度20～24℃，相对湿度40%～70%，采用人工照明按12 h/12 h明暗交替，换气次数15次/h。动物分笼喂养，自由进食和饮水。

1.4 剂量设计与饲喂方式

普通饲料适应性喂养4 d后，动物按性别、体质量随机分成7组，每组20只，雌雄各半。基础饲料对照组：饲喂基础维持饲料；对照玉米低剂量组：饲喂含12.5%非转基因对照玉米的配制饲料；对照玉米中剂量组：饲喂含25%非转基因对照玉米的配制饲料；对照玉米高剂量组：饲喂含50%非转基因对照玉米的配制饲料；转基因玉米低剂量组：饲喂含12.5%转基因玉米的配制饲料；转基因玉米中剂量组：饲喂含25%转基因玉米的配制饲料；转基因玉米高剂量组：饲喂含50%转基因玉米的配制饲料。饲喂时长为90 d。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 动物的一般观察

每日观察动物的活动情况、毛色、摄食及排泄情况，中毒症状及出现时间和死亡情况。观察大鼠生长发育情况，记录每周大鼠进食量和体质量，实验结束后计算每周进食量、体质量、食物利用率及总进食量、总体质量增量、总食物利用率。

1.5.2 血常规检测

实验末期动物禁食16 h后按50 mg/kg腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉取血。取EDTA·K抗凝全血测定红细胞压积、血小板计数(PLT)、红细胞计数(RBC)、血红蛋白(HGB)、白细胞计数(WBC)及其分类，凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)。

1.5.3 血生化检测

取全血凝集离心后的血清测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血糖(GLU)、尿 素 氮(BUN)、肌 酐(CREA)、总 胆 固 醇(CHO)、甘油三酯(TG)、谷氨酰转肽酶(GGT)、氯(Cl)、钾(K)、钠(Na)生化指标。

1.5.4 解剖脏器及病理组织学检查

解剖动物进行大体病理学检查，取脑、心脏、胸腺、肾上腺、肝、肾、脾、睾丸、附睾、子宫、卵巢称量绝对质量，计算脏器相对质量(脏/体比值)。实验结束时解剖取出实验动物的脑、垂体、心脏、肝、肺、脾、肾、前列腺、肾上腺、胃及十二指肠、空肠、回肠、结肠、直肠、甲状腺、胸腺、睾丸和附睾、卵巢和子宫，各脏器各取一块组织浸入4%中性甲醛固定液中固定，制作石蜡组织切片，常规HE染色后，病理组织学显微镜下观察脏器组织学病理变化，记录异常变化。

1.5.5 数据处理

数据以平均值±标准差的形式表示。多组间比较采用方差齐性检验，如果方差齐，进行单因素方差分析(one way ANOVA)；如果方差不齐，进行非参数检验。各剂量转基因玉米组分别与对应剂量的对照玉米组进行比较，各试验组再与基础饲料对照组进行比较，以

P

<0.05判定为显著性差异。

2 结果

2.1 日常观察

结果显示，试验期间各组动物活动自如，被毛有光泽，鼻、眼、口腔无异常分泌物，无中毒死亡情况发生。

2.2 转基因玉米对大鼠体质量与进食量的影响

大鼠体质量与进食量见表1，雄性动物对照玉米中剂量组和转基因玉米中剂量组体质量增量高于对照组，对照玉米中剂量组总进食量高于对照组，对照玉米低剂量组、转基因玉米低剂量组和转基因玉米高剂量组食物利用率高于对照组，差异有统计学意义(

P

<0.05)；雌性动物体质量增量、总进食量和总食物利用率与对照组比较，差异均无统计学意义(

P

>0.05)。其余各组进食量和体质量与对照组比较差异均无统计学意义(

P

>0.05)

表1 大鼠的体质量增量、总进食量与总食物利用率(n=10，x±s)

2.3 转基因玉米对大鼠脏器系数的影响

转基因玉米对大鼠脏器系数的影响见表2：雄性动物对照玉米中剂量组脑/体比低于对照组，差异有统计学意义(

P

<0.05)。雌性动物转基因玉米高剂量组子宫/体高于对照玉米高剂量组，对照玉米低剂量组脾/体高于对照组，差异有统计学意义(

P

<0.05)。但未见其生物学意义；其余各组脏器系数与对照组比较，差异均无统计学意义(

P

>0.05)。

表2 各组大鼠脏器系数表(%，n=10，x±s)

2.4 转基因玉米对大鼠血液生化指标的影响

转基因玉米对大鼠血液生化指标的影响见表3。实验末期，雄性动物转基因玉米高剂量组ALB高于对照玉米高剂量组；对照玉米中剂量组GGT和BUN高于对照组，对照玉米高剂量组CRE和CHO低于对照组，转基因玉米低剂量组CRE低于对照组，差异有统计学意义(

P

<0.05)；但未见生物学意义。雌性动物对照玉米低剂量组AST低于对照组，对照玉米中剂量组ALP高于对照组，对照玉米高剂量组CHO低于对照组，转基因玉米低剂量组CHO低于对照组，转基因玉米中剂量组ALP低于对照玉米中剂量组，BUN高于对照组，CHO低于对照组，CRE低于对照玉米中剂量组，转基因玉米高剂量组BUN高于对照玉米高剂量组，差异均有统计学意义(

P

<0.05)；雄性动物中，对照玉米中剂量组、对照玉米低剂量组和转基因玉米低剂量组Na低于对照组，差异均有统计学意义(

P

<0.05)；转基因玉米中剂量组Na高于对照玉米中剂量组，差异有统计学意义(

P

<0.05)；转基因玉米低剂量组K高于对照玉米低剂量组，差异有统计学意义(

P

<0.05)；对照玉米中剂量组和对照玉米高剂量组Cl低于对照组，差异有统计学意义(

P

<0.05)；转基因玉米高剂量组Cl高于对照玉米高剂量组，差异有统计学意义(

P

<0.05)；雌性动物中，转基因玉米中剂量组Na高于对照组，差异均有统计学意义(

P

<0.05)；对照玉米高剂量组K高于对照组，差异均有统计学意义(

P

<0.05)；转基因玉米低剂量组Cl高于对照玉米低剂量组，差异均有统计学意义(

P

<0.05)；但未见生物学意义。其余各组各项生化指标与对照组比较，差异均无统计学意义(

P

>0.05)。

表3 大鼠血液生化指标(n=10，x±s)

2.5 转基因玉米对大鼠血常规指标的影响

转基因玉米对大鼠血常规指标的影响见表4，实验末期，雄性动物转基因玉米低剂量组中性粒细胞百分比高于对照组和对照玉米低剂量组，转基因玉米中剂量组中性粒细胞百分比高于对照组和对照玉米中剂量组，转基因玉米中剂量组淋巴细胞百分比低于对照组和对照玉米中剂量组，转基因玉米中剂量组单核细胞百分比高于对照玉米中剂量组，对照玉米低剂量组和转基因玉米中剂量组红细胞压积百分比低于对照组，差异有统计学意义(

P

<0.05)；雌性动物对照玉米低剂量组血小板计数和单核细胞百分比均低于对照组，对照玉米高剂量组血小板计数低于对照组，嗜酸细胞百分比高于对照组，转基因玉米低剂量组单核细胞百分比高于对照玉米低剂量组，转基因玉米中剂量组单核细胞百分比高于对照玉米中剂量组，转基因玉米高剂量组嗜酸细胞百分比低于对照玉米高剂量组，差异有统计学意义(

P

<0.05)；但未见生物学意义。雄性动物转基因玉米低剂量组和转基因玉米中剂量组凝血酶原时间低于对照组，差异有统计学意义(

P

<0.05)。上述指标均在本检测单位正常值范围内，无剂量反应关系，无生物学意义。其余各组各项指标与对照组比较，差异均无统计学意义(

P

>0.05)。

表4 大鼠血常规指标(n=10，x±s)

2.6 病理组织学检查结果

试验结束后，解剖大体观察各组主要脏器未见明显病变。通过镜下观察，转基因高剂量组、亲本高剂量组与对照组比较，未发现转基因样品引起实验动物典型病理组织学改变和特异性损伤改变。

3 讨论

将转

cry1Ab

、

cry3Bb

、

cp4epsps

、

ZmHPT

和

ZmTMT

基因抗虫耐除草剂品质性状改良玉米和非转基因对照玉米分别掺入饲料(比例分别为50%、25%、12.5%)喂饲大鼠90 d，试验期间各组动物活动自如，被毛有光泽，鼻、眼、口腔无异常分泌物，无中毒死亡情况发生。试验期间，部分对照玉米组和转基因玉米组动物体质量、进食量与常规基础饲料对照组比较，差异有统计学意义(

P

<0.05)，部分转基因玉米组动物体质量、进食量与对照玉米组比较，差异有统计学意义(

P

<0.05)，但均未见其生物学意义；其余各组动物体质量增量、总进食量和总食物利用率与相应对照组比较，差异均无统计学意义(

P

>0.05)。个别转基因玉米组和对照玉米组动物脏体比与常规基础饲料对照组比较有显著性差异(

P

<0.05)，个别转基因玉米组动物脏体比与对照玉米组比较差异有统计学意义(

P

<0.05)，但无生物学意义；其余各组动物脏体比值与相应对照组比较，差异均无统计学意义(

P

>0.05)。

实验末期对照玉米组和转基因玉米组部分血液学指标、血生化指标与常规基础饲料组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，转基因玉米组部分血液学指标、血生化指标与对照玉米组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，但均在本检测单位正常值范围内，无剂量反应关系，无生物学意义。动物解剖时，大体观察未发现异常。病理组织学检查未发现转基因样品引起实验动物有典型病理组织学改变和特异性损伤改变。

综上所述，采用转cry1Ab、cry3Bb、cp4epsps、ZmHPT和ZmTMT基因抗虫耐除草剂品质性状改良玉米进行大鼠90 d毒性实验未发现明显的生物学意义。本研究还将结合理化检测实验、转基因表达蛋白的急性毒性实验等研究，综合评价该转基因玉米的食用安全性，为进一步的安全性评价提供重要实验依据。