丝状支原体山羊亚种对山羊的致病性观察

陈芙，袁婷，郝华芳，储岳峰，颜新敏*，王鹏雁

(1. 中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室，甘肃 兰州 730046;2. 石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832001)

羊支原体肺炎(Mycoplasma pneumonia of sheep and goats,MPSG)在我国长期普遍流行，危害巨大。MPSG病原复杂，根据文献报道，我国MPSG的病原至少包括：山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae, Mccp)、绵羊肺炎支原体(Mycoplasmaovipneumoniae,Mo)和丝状支原体山羊亚种(Mycoplasmamycoidessubsp.capri,Mmc)等[1-3]。这3种病原引起的疾病临床表现以肺炎、胸膜炎等呼吸系统症状为主，但文献报道Mmc还可导致乳腺炎、关节炎、角膜炎和败血症等综合征(MAKePS)，是传染性无乳症(contagious agalactia, CA)的病原之一[4-6]。本实验室前期对由Mccp和Mo引起的羊支原体肺炎进行了较为系统的研究，已通过构建人工感染模型等工作研发了相应的疫苗和诊断试剂，并实现了产业化[7-8]。但目前对Mmc感染的防控技术研究，国内外报道的不多[9-11]。建立有效的动物模型是深入了解病原致病机制和研发疫苗等防控技术的基础。本文采用Mmc国内分离株对山羊进行人工感染试验观察，初步了解Mmc感染后山羊的临床表现和病理特征，为下一步建立Mmc人工感染模型和我国MPSG病原学研究积累数据。

1 材料与方法

1.1 菌株

丝状支原体山羊亚种Mm1901株，中国农业科学院兰州兽医研究所分离、鉴定和保存。

1.2 试验动物

来自甘肃榆中某羊场的6月龄左右、体重12 kg中卫白山羊6只，随机平均分为2组，攻毒组和对照组。荧光定量PCR(qPCR)检测鼻拭子样品中Mmc核酸[12]，间接血凝试验检测Mmc抗体[13]皆为阴性。

1.3 试验试剂

MTB和MTA培养基，参考文献[1]制备。PremixTaq和DNA Marker DL2000，购自大连宝生物有限公司；细菌DNA提取试剂盒和组织DNA提取试剂盒(离心柱型)，购自天根生化科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 攻毒菌液准备

用MTB培养基按照1∶10比例接种复苏Mm1901株F2代冻存菌液，经传代2次扩大培养，待培养基颜色变黄后8 000 r/min离心15 min进行10倍浓缩，将离心菌体与10 mL上清液混合浓缩后作为攻毒菌液。同时测定菌液的菌落形成单位(CFU)(结果为1.0×109CFU/mL)，并接种血平皿做无菌检测(应无菌生长)。

1.4.2 人工感染

人工感染程序参考文献[14]进行：第1天鼻腔喷雾攻毒2 mL/只，每个鼻孔各1 mL；第2天同样喷雾感染；第5天气管注射6 mL/只。对照组喷鼻和注射同样体积的生理盐水[8-10]。

从第0天开始，每天测量体温，记录临床表现，攻毒前后、剖检前取全血测定血常规。

死亡(鼻腔攻毒后第8天，攻毒程序结束后第3天)和濒临死亡羊剖检并记录病变，同时取肺脏、脾脏、肝脏、肾脏、气管等组织样品进行支原体病原学检测，并送成都里来生物科技有限公司做病理观察。

1.4.3 Mmc病原学检测

1.4.3.1 引物及反应体系、程序

根据文献[12]合成引物(见表1)，并按照已公布的反应体系及反应条件进行。反应体系：SYBR PremixExTaqⅡ(2×) 12.5 μL，Mmc-1700F 0.5 μL，Mmc-1770R 0.5 μL，模板2 μL，水补足至25 μL。反应条件：95 ℃ 30 s预变性；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。

表1 引物信息

1.4.3.2 标准曲线的建立

将复苏的菌液提取DNA，测定浓度并计算拷贝数，调整浓度为1.0×109拷贝数/μL后进行10倍梯度稀释，取1.0×108～1.0×102拷贝数/μL共7个浓度梯度样品，作为模板按反应体系与反应条件进行扩增，以各梯度起始模板浓度之对数值为x轴，以反应之Ct值为y轴，绘制标准曲线。

1.4.3.3 样品检测

将剖检获取的各组织样品组织研磨，试剂盒提取DNA，同时进行分离培养，对阳性培养物提取DNA，同时利用合成的引物进行qPCR定量检测组织。

1.5 数据统计与分析

采用Graphpad Prism 5软件，对血常规参数进行双因素方差分析(Two-way ANOVA) 。数据以“平均数±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 临床症状

山羊鼻腔接种培养物后无明显临床表现，但气管攻毒后第2 天体温明显上升，最高可达41.2 ℃，并出现精神沉郁、食欲废绝、精神异常(卧地或呆立)、头颈僵直、背腰拱起、腹肋紧缩、咳嗽、口鼻流涎、呼吸极度困难(张口呼吸)、颤动，胸部按压有痛感等临床症状。其中1只羊在气管攻毒后第3天(喷鼻后第8 天)死亡，其余2只羊濒死，同时处死、剖检。

2.2 剖检变化

全部攻毒羊颈部皮下水肿严重(下颌至胸前)，气管上有出血点，呼吸道内含有泡沫样物质，气管被胶冻样渗出物包裹。肺淤血、出血，大部分肺组织红色肉变，纵膈、肺门淋巴结淤血。肾脏表面、皮质有淤血和出血点。脾脏有淤血、梗死灶。心脏水肿有心包积液，透明无色，左心耳淤血。瘤胃鼓气，瓣胃、真胃无食。

2.3 血液参数变化

使用Graphpad Prism 5软件对攻毒组与对照组山羊在攻毒前后时间点的组间及组内进行血液参数分析，其中对照组在第0天和第8天均无差异性(P>0.05)。攻毒组第0天白细胞总数(图1a，P<0.05)、中间细胞比率(图1b，P<0.01)、红细胞总数(图1c，P<0.01)显著或极显著高于第8天，粒细胞比率第0天显著低于第8天(P<0.05)。攻毒组白细胞总数在攻毒第8天显著低于对照组(P<0.05)。血红蛋白含量(图1e)均无差异性(P>0.05)。

*表示P<0.05，**表示P<0.01

2.4 病理组织学变化

肺脏间质轻度炎细胞浸润，主要为核圆形深染的淋巴细胞和分叶核的中性粒细胞，支气管周围可见多量炎细胞成团浸润，以淋巴细胞为主(图2a)；肝脏血管内见少量中性粒细胞边缘化，组织少量炎细胞浸润(图2b)；脾脏红髓内少量含铁血黄素沉积(图2c)；气管固有层细胞灶性坏死，并伴有较多炎细胞浸润，以淋巴细胞为主，周围和固有层下脂肪组织内轻度出血，见红细胞溢出血管(图2d)；肾小球玻璃样变，肾小囊腔内数量不等的嗜伊红圆形小体沉积，肾小管上皮空泡变性，见胞质内含大小不等的空泡(图2e)。

a.肺脏间质轻度炎细胞浸润;b. 肝脏少量炎性细胞浸润;c. 脾脏红髓内含铁血黄素沉积;d.气管固有层细胞灶性坏死;e. 肾小球玻璃样变、肾小管上皮空泡变性

2.5 病原学检测

2.5.1 Mmc-qPCR标准曲线建立

从图3可见，基因组参考品起始模板浓度与对应的Ct值表现出良好的线性关系，其相关系数R2=0.997，其扩增效率E=91.7%，直线方程是y=-3.537log(x)+49.260。

图3 qPCR检测Mmc的标准曲线

2.5.2 攻毒羊组织样品检测

共获得23份攻毒羊各部位组织样品，其中心脏3份、肝脏3份、脾脏3份、肺脏3份、肾脏3份、血液3份、皮下水肿液2份、气管渗出物2份、尿液1份。除尿液样品分离培养为阴性外，其余均为阳性。qPCR检测结果一致，尿液样未检出Mmc。

用qPCR比较攻毒羊各组织器官Mmc含量(表2)，其中含量较高的为肺脏(Ct值为16～17)和脾脏(Ct值为17～18)。

表2 qPCR检测对照组与攻毒组羊各组织中Mmc含量

3 讨论

本试验利用一定剂量的Mmc分离株培养物人工感染山羊进行致病性观察，临床症状与剖检与已发表文献[15]描述一致。病理学观察结果由于病程短，组织脏器发现不同程度的炎性细胞浸润，除气管出现灶性坏死，其余组织细胞未见明显病理变化，间接血凝血清抗体检测由于感染时间短，因此尚未转阳。血常规变化显示白细胞总数、中间细胞比率、红细胞总数、中性粒细胞比率攻毒前后存在显著差异性，血红蛋白均无差异性，提示山羊机体组织损伤、炎症反应、贫血脱水及红细胞损伤。qPCR均能够从心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、血液、皮下水肿液等检测到Mmc的DNA，检出含量较高的组织器官为肺脏(Ct：16～17)和脾脏(Ct：17～18)。这些结果，均可说明Mmc可引起山羊严重的急性呼吸道症状、急性炎症和全身性脏器病理损伤，与文献中记载Mmc可导致MAKePS一致[1-6]。

Mmc是一种系统性感染病原，尽管是我国报道的羊支原体肺炎病原之一[1-3,11]，但与我国流行的其他两种羊支原体肺炎病原(Mccp和Mo)只引起肺脏、胸腔等呼吸道症状不同，Mmc对宿主毒力和致死性可能更强。目前，我国Mmc分布、危害等流行病学资料较少，可能是由于支原体不易培养，不是病原学检测实验室常规检测项目，导致支原体病原常被自然忽视和漏检。但随着我国奶羊产业规模扩大和产业兴起，加强对能引起传染性无乳症和支原体肺炎的Mmc检测和调查，对我国奶羊产业健康发展非常重要。

总之，本试验在实验室初步证实了Mmc的系统性感染特点，确定了关键致病表现和病理变化特征。下一步将通过剂量分组和不同接种途径，探索建立Mmc人工感染山羊模型，为Mmc防控技术研究提供支撑。